程麗　胡茂龍　浦惠明　龍衛(wèi)華　高建芹　陳鋒　周曉嬰　張維　陳松　張潔夫

摘要：M342是利用EMS誘變定向選育獲得的甘藍型油菜抗磺酰脲類除草劑新種質(zhì)。通過M342抗性基因與敏感型油菜的ALS基因序列分析結(jié)果表明，M342的BnALS3基因存在1處SNP突變，導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)第556位色氨酸突變?yōu)榱涟彼?，該突變?dǎo)致基因序列對BsrDI內(nèi)切酶消化的差異。為此設(shè)計了8條引物，從中篩選到引物對SU54F/SU58R在不同油菜品種中可以特異性擴增出目的片段，該片段經(jīng)BsrDI酶切分型正確，從而開發(fā)了檢測M342中抗性基因BnALS3R的CAPS標記。運用該標記對除草劑敏感型油菜純合抗性油菜及雜合抗性油菜BnALS3的基因型進行驗證，并應(yīng)用該標記對F、BC分離群體進行檢測。結(jié)果表明，該標記驗證的基因型結(jié)果與測序結(jié)果一致。F分離群體有Als3Als3、Als3als3、als3als3 3種基因型，BC分離群體有Als3als3、als3als3 2種基因型，與表型鑒定結(jié)果一致，遵循單基因遺傳分離規(guī)律，表明該標記可以應(yīng)用于抗性基因的檢測。CAPS標記的獲得為抗除草劑油菜的分子標記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：油菜;磺酰脲類除草劑;乙酰乳酸合酶;酶切擴增多態(tài)性序列（CAPS）標記

中圖分類號：Q789

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0241-07

有效治理田間雜草是油菜實現(xiàn)機械化、輕簡化生產(chǎn)的一個重要環(huán)節(jié)，化學(xué)除草是目前控制農(nóng)田雜草最有效的手段?；酋ｋ澹⊿ulfonylurea，SU）類除草劑因其具有高效低量，對動物無害，高選擇性，土壤殘留期短等優(yōu)點被應(yīng)用于水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestium L）、玉米（Zea mays）等單子葉作物田間雜草的防除”。油菜（Brassica napus L.）為雙子葉植物，對商業(yè)化的磺酰脲類除草劑敏感，選育抗SU類除草劑的油菜新品種，拓寬現(xiàn)有SU類除草劑的應(yīng)用范圍，是油菜田間雜草治理經(jīng)濟有效的途徑。

SU類除草劑屬于乙酰羥基酸合酶（AHAS）抑制劑類除草劑，作用靶標是AHAS。AHAS也叫乙酰乳酸合酶（ALS），是植物支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）生物合成過程中的關(guān)鍵酶。除SU類外，ALS類除草劑還包括咪唑啉酮類（Imidazolino-nes，IMIl）、三唑嘧啶磺酰胺（Triazolopyrimidines，TZ）、嘧啶水楊酸類（Pyrimidyloxy-benzoates，PB）和磺酰氨羧基三唑啉酮類（Sulfonlyaminocarbonyl-tri-azolinones，SCT）等。這類除草劑的殺草機理是除草劑分子與ALS形成復(fù)合物阻斷底物進入酶活性位點通路，抑制ALS活性，導(dǎo)致支鏈氨基酸合成受阻，生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成被破壞，使植物失綠、黃化，最后逐漸死亡。植物產(chǎn)生抗性是由于其ALS基因發(fā)生了若干堿基位點的突變，造成編碼蛋白質(zhì)氨基酸殘基位點變異，從而改變除草劑與ALS的結(jié)合方式產(chǎn)生抗性。在已發(fā)現(xiàn)的抗性突變體中，主要涉及8個ALS氨基酸位點突變，這8個位點分別是Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654[以擬南芥（Arabidopsisthaliana）的ALS氨基酸位置計算]，其中對SU類除草劑產(chǎn)生抗性的氨基酸突變位點主要有Pro197、Ala205和Trp574。在油菜中，Swanson等通過誘變油菜小孢子獲得了對IMI類除草劑具有抗性的油菜P1和P2。P1的抗性突變位點是BnALSI的Ser653Asp，P2的抗性突變位點是BnALS3的Trp574Leu。Magha等在培養(yǎng)油菜原生質(zhì)體后代時發(fā)現(xiàn)突變體RCS-5對SU類和IMI類除草劑具有抗性，但未揭示突變位點。有研究者在大豆（Glycinemax）和油菜輪作的試驗田中發(fā)現(xiàn)1株抗IMI類除草劑油菜M9，并揭示了M9的突變位點為BnALSI的Ser653Asp。浦惠明等利用EMS誘變和定向選育技術(shù)，獲得了抗SU類除草劑的甘藍型油菜突變體M342。M342在苯磺隆推薦使用質(zhì)量濃度下無任何藥害癥狀，仍能正常生長。胡茂龍等進一步通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆得到M342抗性基因，突變位點為BnALS3的Trp574Leu。根據(jù)該突變體BnALS3的突變位點，開發(fā)檢測油菜抗SU類除草劑性狀的分子標記，通過標記快速區(qū)分油菜中抗性基因的基因型，指導(dǎo)油菜抗性育種，加快選育進程。

酶切擴增多態(tài)性序列（Cleaved amplified poly-morphic sequence，CAPS）是通過設(shè)計特異性引物擴增出目的片段，然后通過限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，電泳檢測不同大小的酶切片段來檢測基因型的技術(shù)。CAPS標記是PCR和RFLP（Restrictionfragment length polymorphism）的有機結(jié)合，該方法快速直觀，避免了RFLP分析中膜轉(zhuǎn)印這一繁瑣步驟，又能保持RFLP分析的精確度，且是共顯性標記，已廣泛應(yīng)用于靶基因突變導(dǎo)致的抗性植株的檢測。然而，在油菜中利用CAPS標記檢測抗除草劑的突變基因還鮮見報道。本研究以M342抗性突變體為材料，開發(fā)能快速準確檢測抗性基因BnALS3R基因型的CAPS標記，為油菜抗除草劑分子輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

M342、M294-2等純合抗性材料是由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所油菜研究室在EMS誘變體庫中通過非選擇性除草劑大群體定向篩選或通過與M342雜交回交轉(zhuǎn)育獲得，寧油20號，N131、D1-2、D3-1等敏感材料，MICMS雙低恢復(fù)系N221、N340和N341由本研究室保存。

高保真性DNA聚合酶KOD-Plus及PCR試劑購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，克隆載體pEASY-1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。DNA分子量標準、普通TaqDNA聚合酶、dNTPMixture、10XExTaq Buffer PCR、PCR產(chǎn)物平末端加A試劑盒均購自TaKaRa生物工程有限公司（中國大連）。大腸桿菌E.coli DH5a由本實驗室保存。引物合成、DNA測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。BsrDI限制性內(nèi)切酶（NEB）購于南京偉沃生物科技有限公司。苯磺隆除草劑為江蘇省激素研究所股份有限公司生產(chǎn)的10%苯磺隆可濕性粉劑。

1.2 CAPS標記開發(fā)

利用EMS誘變和定向選育技術(shù)，我們獲得了甘藍型油菜抗SU類除草劑突變體M342，該突變體是BnALS3基因起始密碼子第一個核苷酸下游的+1667位點單堿基G突變?yōu)門，導(dǎo)致第574位色氨酸突變?yōu)榱涟彼幔ㄒ詳M南芥的ALS氨基酸位置計算）。隨后，運用PrimerPremier5分析了M342和野生型油菜N131之間酶切位點的差異，發(fā)現(xiàn)野生型油菜N131的BnALS3基因+1667位點的堿基G與其上游+1662至+1666的5個堿基構(gòu)成的核苷酸序列“GCAATG”是限制性內(nèi)切酶BsrD I的識別剪切位點。為明確該序列在多個敏感型油菜品種中的保守性，設(shè)計了引物對A1（表1），采用CTAB法對敏感型油菜寧油20號、N221、N340和N341提取DNA，PCR克隆4個油菜品種的BnALS3基因。PCR反應(yīng)體系包含1.0μlDNA模板、2.0μl10x酶反應(yīng)緩沖液、1.2μl25mmol/LMgSO4、2.0μl2mmol/LdNTPs.0.8μl1U/LKOD-PlusTaq酶、13.0μlH20。反應(yīng)程序94C預(yù)變性5min;94C變性30s，55C退火30s，72C延伸2min，35個循環(huán);72C延伸5min。按照試劑盒使用說明書對PCR產(chǎn)物進行平末端加A后，用1%（質(zhì)量體積比）的瓊脂糖凝膠電泳回收純化，回收片段連接pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ar，挑取陽性克隆測序。

甘藍型油菜AC基因組有3個ALS功能基因，其中C基因組上的BnALSI和A基因組上的BnALS3在核酸和蛋白水平同源性達98%，為了避免不同油菜品種BnALSI對抗性基因檢測的干擾，設(shè)計引物對A2，同樣對寧油20號、N221、N340和N341的BnALSI基因進行克隆、測序。利用DNA-MAN V6軟件分析M342、N131、寧油20號、N221、N340和N341的BnALSI、BnALS3基因序列差異，在BnALS3基因+1662～+1667序列的兩端設(shè)計了8條引物（表1），正反引物分別錨定在BnALSI、BnALS3核苷酸差異序列上，以期特異性擴增BnALS3基因片段。接著以M342的5個單株，上述5種除草劑敏感型油菜（N131、寧油20號、N221、N340和N341）以及M342的5個單株為父本與上述5種除草劑敏感型油菜為母本雜交的F，為材料，提取油菜基因組DNA，使用上述8條引物組合成的16對引物進行擴增。反應(yīng)體系如下：20ngDNA，0.5μmol/L引物，1x酶反應(yīng)緩沖液，1.5mmoL MgCl，0.2mmol/LdNTP，0.5UTaq酶。PCR擴增程序為：94C預(yù)變性5min;94C變性30s，55C退火30s，72C延伸45s，共35個循環(huán);72C延伸5min，4C保存。PCR產(chǎn)物一部分純化測序，一部分用限制性內(nèi)切酶進行酶切，25.0μl酶切反應(yīng)體系包括：PCR產(chǎn)物5.0μl，10x酶反應(yīng)緩沖液2.5μl，內(nèi)切酶0.5μl，水17.0μl。65C下反應(yīng)3～5h。用1.5%（質(zhì)量體積比）的瓊脂糖凝膠檢測酶切產(chǎn)物。

1.3 CAPS標記的驗證

對抗性油菜M294-2、敏感型油菜D1-2和抗性油菜M305、M306與敏感型油菜D42.D162雜交的F，及親本種子進行萌發(fā)。7d后，取適量幼苗提取DNA，并用1%（體積質(zhì)量比）的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測DNA濃度和純度。引物對SU54F/SU58R擴增出目的片段，并用BsrD I進行酶切，驗證CAPS標記。DNA提取、PCR反應(yīng)、酶切分型方法同方法1.2。

1.4 應(yīng)用CAPS標記檢測油菜分離群體中BnALS3R的基因型

用MICMS雙低恢復(fù)系N221與M342配制F播種F套袋自交后得到F群體，F(xiàn)單株分別與N221進行回交獲得BC群體。當年秋季種植F、BC分離群體材料，待油菜生長至3到5葉期，噴施質(zhì)量濃度為45g/hm（a.i）的苯磺隆鑒定分離群體中各單株除草劑抗性噴藥前取適量F、BC分離群體單株和親本的葉片保存于-20C，用于DNA提取。利用引物對SU54F/SU58R擴增出目的片段，并用BsrD I酶切分型。DNA提取，PCR反應(yīng)、酶切分型方法同方法1.2。

2結(jié)果與分析

2.1 油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的CAPS標記

利用A1引物PCR克隆獲得了敏感型油菜寧油20號、N221、N340和N341的BnALS3基因序列。序列比對發(fā)現(xiàn)，在+1662～+1667位點的6個核苷酸序列均為“GCAATG"，與野生型油菜N131相同，表明該序列在敏感型油菜中具有高度保守性。16對引物分別對多個油菜品種進行PCR擴增，多次PCR，擴增結(jié)果表明，有些引物對無PCR產(chǎn)物，有些引物對PCR非特異擴增出多個條帶，不利于進行酶切反應(yīng)。其中引物對SU54F/SU58R能特異性擴增出目的條帶，該條帶經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)屬于BnALS3基因片段，在敏感型和抗性油菜中存在G/T突變位點。

PCR產(chǎn)物經(jīng)BsrDI酶切后顯示，抗磺酰脲類除草劑油菜M342的5個單株均為只有1條766bp的條帶，敏感型油菜N131、寧油20號、N221、N340和N341均為含有570bp.196bp2條條帶，F(xiàn)均為含有766bp、570bp和196bp3條條帶（圖1）。田間苗期油菜噴施苯磺隆后，未發(fā)現(xiàn)M342及雜交F，單株死亡，但5種敏感型油菜噴藥20d后全部死亡。上述結(jié)果表明，從16對引物篩選出的引物對SU54F/SU58R可以作為抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的CAPS標記引物，該CAPS標記可以準確檢測出油菜種質(zhì)資源中是否含有抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R。

2.2 CAPS標記在油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R中的驗證

利用CAPS標記對不同油菜的抗性基因

BnALS3R進行檢測，結(jié)果表明M294-2、M295-1、M296-1、M297-1、M298-1、M299-1、M300-1、M301-1、M303-1、M304-1、M305-1、M306-2、M307-1是純合抗性油菜，酶切產(chǎn)物只有1條分子量為766bp的條帶;D1-2、D3-1、D4-1、D7-1、D8-2、D9-1、D10-2是敏感型油菜，酶切產(chǎn)物分別有570bp、196bp的2條條帶（圖2），該CAPS標記的檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致。

純合抗性油菜M305、M306的CAPS標記檢測結(jié)果表明只有1條766bp的條帶，敏感型油菜D42、D162的酶切結(jié)果顯示570bp和196bp2條條帶（圖3），均與其基因型結(jié)果一致。分別將M305、M306與D42、D162進行雜交，雜交后代F，基因型是雜合型，以F，幼苗的DNA為模板，擴增片段酶切后分別有766bp、570bp和196bp3條條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3）。

2.3 應(yīng)用CAPS標記檢測油菜分離群體BnALS3R的基因型

利用CAPS標記技術(shù)對F、BC群體進行檢測，結(jié)果表明F群體CAPS標記呈現(xiàn)3種基因型條帶（圖4），即酶切產(chǎn)物為766bp1條條帶，為抗磺酰脲類除草劑Als3Als3純合抗性植株，如單株4～8;酶切產(chǎn)物為766bp、570bp和196bp3條條帶，為Als3als3雜合抗性植株，如單株9～18;酶切產(chǎn)物為570bp和196bp2條條帶，為als3als3純合敏感植株，如單株19～23，CAPS標記分析結(jié)果與抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R基因型測序結(jié)果一致。BC群體CAPS標記分析呈現(xiàn)2種基因型條帶（圖5），即酶切產(chǎn)物為766bp、570bp和196bp3條條帶，為雜合抗性Als3als3植株，如單株4～13;酶切產(chǎn)物為570bp和196bp2條條帶，為敏感als3als3植株，如單株14～23。以上2個群體CAPS標記結(jié)果與苗期噴施苯磺隆表型鑒定結(jié)果一致，并且F和BC群體的CAPS標記結(jié)果遵循孟德爾單基因遺傳分離規(guī)律，因此該CAPS標記可以有效地檢測分離群體BnALS3R的基因型。

3 討論

傳統(tǒng)的育種方式主要是根據(jù)表型進行選擇，而環(huán)境條件、基因間互作、基因型等多種因素會影響對植株的選擇，育種周期較長。分子標記輔助育種技術(shù)可以提高育種的準確性和效率，在農(nóng)業(yè)育種中發(fā)揮重要的作用。理想的分子標記能在廣泛的遺傳背景下有效追蹤目標基因，重復(fù)性高。CAPS標記技術(shù)將PCR擴增和酶切反應(yīng)相結(jié)合，具有操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，已廣泛用于植物抗除草劑基因的檢測。運用CAPS標記技術(shù)，Massa等檢測了阿披拉草（Apera spica-renti）ALS基因Pro197突變體。Yu等對野麥草（Hordeum lepo-rinum Link.）ALS基因Pro197突變體基因檢測，隨后對硬直黑麥草（Lolium rigidum Gaud.）ALS基因Pro197、Trp574突變體進行基因分型。鄧維運用CAPS標記快速檢測播娘蒿（DescurainiasophiaL.）ALSI或ALS2的Pro197、Asp376和Trp574突變體。然而，由于在播娘蒿中ALSI、ALS2基因同源性達到了96.4%，設(shè)計的引物可同時擴增出ALSI、ALS2，但酶切無法明確區(qū)分Pro197突變體究竟是ALSI還是ALS2基因位點的突變。甘藍型油菜是由白菜型油菜和甘藍天然雜交形成的異源四倍體，包括A、C基因組，基因組內(nèi)3個具有催化功能的ALS基因核酸序列高度同源，尤其是ALSI和ALS3，同源性達到98%，這為開發(fā)檢測抗SU類除草劑油菜抗性基因BnALS3R的分子標記增加了難度。本研究通過克隆比對BnALSI和BnALS3序列差異設(shè)計出8條引物，從組合的16對引物中篩選出1對引物（SU54F/SU58R）能特異擴增出不同油菜品種中與BnALSI高度同源的BnALS3R基因片段，且酶切分型正確，為利用抗性基因進行油菜抗除草劑分子標記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)外至今還未有培育出商業(yè)化的抗SU類除草劑油菜品種的公開報道，主要原因是缺少抗性種質(zhì)。因此，篩選鑒定具有生產(chǎn)應(yīng)用價值的抗SU類除草劑油菜新種質(zhì)成為迫切需要。Magha等發(fā)現(xiàn)突變體RCS-5對SU類和IMI類除草劑具有抗性，但未揭示抗性位點。Li等通過篩選EMS突變后代群體鑒定出幾株抗苯磺隆突變體，其突變位點為BnALS3第197位Pro突變?yōu)镾er/Leu。曲高平等報道在3x10*株的EMS誘變M2群體中篩選到K1、K4、K5共3株苯磺隆抗性突變體，隨后揭示了突變體K1、K4均為BnALS3第535位堿基C突變?yōu)閴A基T導(dǎo)致BnALS3第197位Pro突變?yōu)镾er，K5為BnALSI第544位堿基C突變?yōu)閴A基T導(dǎo)致BnALSI第197位Pro突變?yōu)镾er，并開發(fā)了SNP標記用于檢測3株突變體基因。通過定向選育方法，我們篩選到抗SU類除草劑油菜M342，該突變體是BnALS3第1667位堿基G突變?yōu)閴A基T導(dǎo)致第574位Trp突變?yōu)長eu，這為抗除草劑油菜種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育奠定了基礎(chǔ)。本研究根據(jù)BnALS3基因Trp574突變位點的SNP，開發(fā)了油菜抗sU類除草劑性狀的CAPS標記，該標記在分離群體中可以準確地鑒定純合抗性油菜、純合敏感油菜及雜合抗性油菜BnALS3R的基因型。同時，該標記是根據(jù)基因的核苷酸突變特性設(shè)計的功能性基因標記，能直接反映植株的抗性，不存在由于遺傳交換而造成的錯誤鑒定，極大地提高了抗性基因的選擇效率。利用該標記可以在油菜任何時期鑒定抗性基因純合型單株以及優(yōu)良性狀的敏感單株，淘汰其他單株，這樣不僅可以節(jié)約田間育種成本，而且可以大大提高抗除草劑油菜品種的選擇進程。

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