竇慧 巫相宏

摘要：目的：探討羅格列酮（rosiglitazone ，RSG）對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導人冠狀動脈內(nèi)皮細胞（HCAEC）功能障礙的作用及機制。方法：將HCAEC分為空白對照組、脂多糖組（分別用0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L四種濃度的LPS刺激HCAEC，同時設立對照組，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細胞活力后選出最適濃度）、羅格列酮（RSG）組、脂多糖+羅格列酮（LPS+RSG）組，采用Western blot（蛋白免疫印跡法）測定縫隙連接蛋白43（Cx43）的表達量。結(jié)果：（1）MTT法檢測四組LPS濃度對細胞活力影響的結(jié)果顯示，隨著LPS濃度增加（LPS濃度≥1 mg/L），抑制HCAEC作用增強，導致其活力降低（P<0.05）；（2）由Western blot結(jié)果表明，LPS組對比空白對照組，Cx43的表達量增多；HCAEC中加入RSG預處理1h后+LPS共培養(yǎng)組較LPS組，Cx43蛋白的表達水平下降（P<0.01）。結(jié)論：RSG能抑制LPS誘導的HCAEC中Cx43表達的增加，減輕冠狀動脈內(nèi)皮細胞功能損害，從而延緩動脈粥樣硬化的進展。

關鍵詞：羅格列酮；縫隙連接蛋白43；脂多糖；人冠狀動脈內(nèi)皮細胞

【中圖分類號】361.3 【文獻標識碼】A 【文章編號】2107-2306（2019）02-160-03

前言

隨著國家綜合實力的提升，人民生活質(zhì)量不斷改善以及計劃生育的施行，中國人口老齡化問題日漸突出，隨之而來，城鄉(xiāng)居民中患動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）疾病占比較前增多。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，與動脈粥樣硬化和再狹窄相關的心血管疾病可能是未來十年發(fā)展中國家導致死亡的主要原因[1， 2]。研究表明，在AS的形成過程中，血管內(nèi)皮的縫隙連接蛋白（connexins，Cx）[3]發(fā)揮了重要作用。羅格列酮可通過p38 MAPK信號通路抑制炎癥反應。該實驗通過觀察羅格列酮對LPS誘導的HCAEC中Cx43表達水平變化的影響，探討羅格列酮是否有抑制血管炎癥反應的作用。

1.材料與方法

1.1 實驗試劑

原代HCAEC、內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)基、青-鏈霉素（P-S）、胰蛋白酶、MTT、LPS、RSG、二甲基亞砜（DMSO）、RIPA裂解液、BCA蛋白試劑盒、兔抗鼠Cx43、兔抗鼠GAPDH內(nèi)參蛋白抗體、羊抗兔熒光二抗。

1.2主要試劑配制

LPS用無血清的培養(yǎng)基溶解，RSG用DMSO溶解，磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解MTT，以上三種溶液放于-20℃冰箱保存。

1.3 細胞培養(yǎng)

將HCAEC從液氮罐中取出置于37℃水浴箱中，溶化后立即轉(zhuǎn)移到含9ml完全培養(yǎng)基的25cm2培養(yǎng)瓶中，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，酌情1-3天換液一次，待瓶內(nèi)細胞密度達80%以上即可傳代。以2-5代為最佳研究對象。

1.4 實驗分組及處理

（1）LPS對細胞活力影響的檢測：用MTT法檢測五組濃度梯度的LPS處理HCAEC 24h后的細胞活力；（2）Western blot法測定以下四組細胞（①空白對照組、②0.1mg/L LPS組、③10ug/ml RSG組、④0.1mg/L LPS+10μg/ml RSG組（先LPS預處理1h后再予RSG共同處理24h））中Cx43蛋白的表達量，上述四組細胞均培養(yǎng)24h后提取總蛋白。

1.5 MTT法檢測細胞活力

當細胞在對數(shù)生長期且密度達80%-90%時，胰酶消化，離心，吹打重懸，于96孔板中每孔接種1×104 個細胞，每個濃度設4個復孔，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，至細胞貼壁生長時，在無血清條件下以不同濃度LPS處理HCAEC 24h，在每孔加入20μl的MTT溶液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，吸棄復孔的上清液，每孔加入150μlDMSO，搖床振蕩10 min，待結(jié)晶溶解后選擇波長490nm的酶標儀測其吸光度值。

1.6 Western blot法檢測HCAEC中Cx43蛋白的表達量

將HCAEC接種于六孔板上，根據(jù)不同組的條件分別處理HCAEC后棄去培養(yǎng)液，使用冷卻的1×PBS清洗3次后棄去，冰上加入提前裝有PMSF的RIPA裂解液裂解10min，用離心管收集細胞刮刮取的裂解物后離心，取一小部分用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，剩余上清液放入1.5ml離心管后加入上樣緩沖液后置于100℃沸水中變性13分鐘。行SDS-PADE電泳，每道上樣20μg蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，1×TBST 洗膜5 min×3次，5%脫脂奶粉封閉1h， TBST洗三次，蛋白一抗4℃孵育過夜， TBST洗三次后加入熒光二抗，室溫搖床孵育1 h， TBST洗3次，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描成像，Image-J圖像分析軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白Cx43與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值反映其相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（X±s）表示，多組組間總體均數(shù)的差異比較用單因素方差（one way ANOVA）分析，組間兩兩比較用SNK檢驗，當P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 不同濃度LPS對人冠狀動脈內(nèi)皮細胞活力的影響

不同濃度梯度LPS處理HCAEC 24h后，以空白組為對照，當LPS濃度大于1mg/L時，HCAEC活力降低（P<0.05），且隨著LPS濃度升高，對HCAEC活性的抑制作用增強。因此，選擇0.1mg/L LPS作為后續(xù)實驗的處理濃度。

2.2 不同處理對HCAEC中Cx43蛋白水平的影響

與對照組（0.45±0.015）相比，LPS組Cx43蛋白（0.58±0.004， P<0.01）水平顯著上升；與LPS組相比，LPS+RSG組Cx43蛋白（0.32±0.025， P<0.01）水平顯著下降。

3.討論

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，其特點是在受累及的動脈某些部位的內(nèi)膜下發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)沉積，伴血管平滑肌細胞增殖和纖維基質(zhì)成分聚集，進一步發(fā)展成動脈粥樣硬化斑塊。脂多糖是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要成分，通過與內(nèi)皮細胞跨膜受體Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）結(jié)合，激活G蛋白激酶傳導通路，引起細胞內(nèi)靶蛋白的磷酸化，促使細胞骨架蛋白的解聚和重組，細胞間縫隙形成，進而改變內(nèi)皮細胞的形態(tài)及功能，導致內(nèi)皮細胞功能障礙，促進AS的發(fā)生發(fā)展[4]。

縫隙連接（gap junction） 是由縫隙連接蛋白（ connexin，Cx）組成的哺乳動物細胞膜上的一個特定區(qū)域，為細胞間離子、小信號分子、第二信使的直接流通通道，協(xié)調(diào)細胞的生長及分化的生理過程。作為細胞間相互連接的主要方式，與動脈粥樣硬化的形成產(chǎn)生重要作用?？p隙連接蛋白是一種在多種組織中表達的蛋白質(zhì)的同質(zhì)家族[5]，其中三種縫隙連接蛋白參與動脈粥樣硬化的形成，分別是Cx37， Cx40 和 Cx43。Cx37和Cx40具有延緩動脈粥樣硬化的作用[6， 7]。Cx43在AS發(fā)生發(fā)展過程中呈表達上調(diào)趨勢，其主要在平滑肌和血管內(nèi)皮細胞中表達[4]。在心室組織中存在大量表達由Cx43組成的縫隙連接，具有高轉(zhuǎn)導、低電阻的特點，其作為基礎使心臟作為一個功能性合胞體進行同步收縮，在維持心臟正常電生理活動中發(fā)揮重要作用[8]。研究證明Cx43通過激活ATP釋放，促進單核細胞和血管內(nèi)皮間的粘附力增加，繼而誘發(fā)血管炎性反應[9]。Cx43 MAPK 磷酸化是血小板源性生長因子介導的血管平滑肌增生所必需的，而后者在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色[10]。該研究使用LPS處理HCAEC細胞，研究揭示： LPS組中Cx43的蛋白表達水平較空白對照組明顯上調(diào)（P<0.01）。提示LPS可能通過增加Cx43的表達量進而促進AS的形成。

核受體超家族中的核轉(zhuǎn)錄因子之一過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ），是脂肪細胞分化的關鍵調(diào)控因子。有研究表明[11]，噻唑烷二酮類合成的PPARγ配體對心血管疾病具有有益的作用。累積的數(shù)據(jù)表明，PPARγ活化是抵抗素蛋白的重要調(diào)控因子[12]，因此有望成為動脈粥樣硬化并發(fā)癥的治療靶點。PPARγ激動劑羅格列酮可通過MAPK信號傳導通路下調(diào)動脈粥樣硬化斑塊病變中的主要蛋白酶MMP-2[13]從而抑制炎癥反應過程。在本實驗中，使用羅格列酮來拮抗LPS誘導的血管炎癥反應，結(jié)果顯示，與LPS組相比，LPS+RSG組的Cx43蛋白表達量明顯下降（P<0.01）。

綜上所述，LPS可誘導HCAEC中Cx43的表達量增多，而羅格列酮可以抑制LPS誘導HCAEC中Cx43的產(chǎn)生，從而起到抗炎保護作用。這也可能為AS的治療提供一種新的治療思路。

參考文獻

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