王靜

摘要：1968年建立的鱟試劑內毒素檢查法是控制藥品熱原反應的重要方法。近年來對內毒素結構功能與作用機制的不斷深入研究，使需要通過鱟試劑進行內毒素檢查的品種呈倍數增加，檢測方法也從定性法發(fā)展到定量法，如何實現生產過程中對藥品內毒素水平的定量檢測成為一項重大課題。本文主要闡述了小容量注射劑生產各環(huán)節(jié)中如何排查和控制細菌內毒素，并記錄了動態(tài)比濁法定量檢測細菌內毒素的實驗結果，更直觀的監(jiān)控生產過程中內毒素含量的變化趨勢。

關鍵詞：細菌內毒素 鱟試驗法 動態(tài)比濁法

【中圖分類號】186.3 【文獻標識碼】A 【文章編號】2107-2306（2019）02-152-03

1.細菌內毒素與熱原反應

細菌內毒素是革蘭陰性菌細胞壁上的脂多糖成分，在細菌死亡或自溶后被釋放，作為外源性致熱源作用于中性粒細胞，使之釋放內源性致熱源而引起發(fā)熱，即熱原反應。WHO文件中提到，在藥檢范圍內控制內毒素就是控制熱原。內毒素通過消化道時或少量注射入血時不造成機體損害，若大量入血，可對機體產生不同程度的致病作用。因此，注射用藥劑、化學藥品類及醫(yī)療器材類等必須經過試驗合格后才能使用。

2015年版中國藥典收錄兩種細菌內毒素檢查法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。

2.細菌內毒素與生產控制

生產小容量注射劑過程中應從體系上總體控制內毒素水平，對物料、人員、生產環(huán)境、藥品生產過程等進行監(jiān)控，了解其初始內毒素負荷，并根據產品設定標準的內毒素限值，分析生產過程中內毒素負荷，合理設置內毒素監(jiān)測點，制定各監(jiān)測點內毒素控制水平，確保產品符合最初設計要求。

2.1物料控制

2.1.1注射用水

注射用水排查中應至少對配制用水使用點和分配系統(tǒng)中總送、回水口注射用水使用點進行內毒素檢查，確定注射用水原始內毒素負荷?！吨袊幍洹?015年版中規(guī)定注射用水細菌內毒素限量為每1ml應小于0.25EU，濁度法能確定注射用水原始內毒素定量值，這對有些內毒素標準要求極為嚴苛的產品來說尤其重要。

2.1.2一般原輔料

要根據小容量注射劑產品的限量要求和原輔料的加入量設置原輔料的內毒素限量標準。目前很多原輔料并沒有設置內毒素檢查標準，因此，同一種原料生產不同制劑時，內毒素標準是不一樣的，非藥典方法設定的內毒素檢查方法應進行內毒素檢查方法學驗證。

2.1.3活性炭

國外目前流行無炭化生產，國內一般還采取傳統(tǒng)的加炭吸附除熱原以控制內毒素?！吨袊幍洹?015年版規(guī)定，檢查活性炭中所含內毒素本底值及活性炭對細菌內毒素吸附力，以確保其原始內毒素負荷和吸附效率，避免因活性炭引入內毒素而帶來不良影響。

2.1.4氣體

對小容量注射劑產品使用的壓縮空氣、氮氣等直接接觸藥品的氣體應進行終端除菌過濾，在無菌驗證合格的基礎上進行細菌內毒素取樣檢測，對樣品進行細菌內毒素濁度法檢查。

2.1.5包裝容器

小容量注射劑一般采用安瓿或西林瓶包裝，最終的清洗滅菌采用隧道滅菌烘箱，烘箱對細菌內毒素的103挑戰(zhàn)試驗應在確認周期內，運行中可以記錄和觀察滅菌溫度、運行速度，以確保工藝去除內毒素的能力。

2.2人員控制

為了維持產品的無菌性，涉及無菌作業(yè)的操作人員在允許進入無菌生產區(qū)和進行操作前都應遵循無菌技術原則，并進行適當培訓，包括無菌服著裝控制、無菌技術、潔凈室行為準則、微生物學、衛(wèi)生、著裝、無菌操作等；并制定經常性培訓計劃定期培訓和考核新內容。

產品灌封結束后，應對操作人員5指手套進行表面微生物取樣檢測，以確認是否產生污染。

2.3生產環(huán)境監(jiān)測

根據GMP2010年的修訂要求，潔凈區(qū)的設計必須符合相應的潔凈度要求，達到“靜態(tài)”和“動態(tài)”的標準，評估無菌生產的微生物狀況；無論生產潔凈室何種方式消毒，均需對消毒效果確認。

2.4生產過程控制

2.4.1配制

除按工藝要求配制外，還需注意配制灌封系統(tǒng)管道排查是否存在設計死角，其清潔及消毒的全過程，藥液及氣體除菌過濾器使用前后的完整性檢查。

對配制藥液取樣：對稀配完成的產品進行原始內毒素負荷取樣；對始終灌封藥液取樣。

2.4.2灌封

按照無菌操作的要求進行灌裝裝配和藥液灌裝。

對灌封產品取樣：每臺灌封始排藥液的取樣；每臺設備灌封前中后產品取樣并標記。

2.4.3滅菌與檢漏

按滅菌工藝滅菌溫度、時間、裝載方式、裝載量等的要求進行滅菌與檢漏。取樣將滅菌前后產品進行細菌內毒素負荷對比。

細菌內毒素與比濁法

因一般傳統(tǒng)凝膠法只進行內毒素限量檢查，無法定量，因此在生產過程中為了解其負荷情況，采用濁度法對內毒素進行定量檢查，便于快速準確地控制內毒素污染狀況，提高產品質量的可控性。

3.1儀器與試藥

LKM-02-32 型動態(tài)試管檢測儀，小容量注射劑生產過程中樣品（鄭州卓峰制藥有限公司自產）、細菌內毒素工作標準品、細菌內毒素檢查用水、鱟試劑。

3.2方法與結果

3.2.1細菌內毒素標準曲線的建立和可靠性分析

用BET檢查用水將細菌內毒素工作標準品稀釋制成終濃度分別為2、0.25、0.03EU/ml的內毒素溶液，各取0.1ml，分別加到預先加入0.1ml鱟試劑的反應管內，混合均勻，插入細菌內毒素檢測儀內進行檢測，每一濃度作3管，同時作陰性對照。以平均反應時間的對數LgT為縱坐標，細菌內毒素的濃度對數LgC為橫坐標，繪制標準曲線。標準曲線的回歸方程為：LgT=-0.28711LgC+2.8020，r=-0.9984（絕對值應大于0.980），平行管之間的RSD均小于10%，陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度反應時間，細菌內毒素標準曲線結果成立。

3.2.2供試品制備及最大有效稀釋倍數的確定

本品細菌內毒素限值為1.2EU/ml，標準曲線的最低濃度為0.03EU/ml，供試品的最大有效稀釋倍數MVD=CL/λ=2（mg/ml）*1.2（EU/mg）/0.03=80倍。

3.2.3干擾試驗

根據標準曲線內毒素濃度的設置，選擇0.25EU/ml作為靠近曲線中點的內毒素濃度，取批號為1801101的樣品，用BET檢查用水將供試品分別稀釋4、8、16、32、80倍，作為供試品溶液1，同時制備含上述供試品并含內毒素為λ0.25EU/ml的溶液2，分別取上述溶液各0.1ml，分別加到預先加入0.1ml鱟試劑的反應管內，混合均勻，插入細菌內毒素檢測儀內進行檢測，每一濃度作2管。測定結束后，按標準曲線回歸方程分別計算供試品溶液和含標準內毒素的供試品溶液的內毒素含量，并計算該試驗條件下的回收率R。

另取批號為2、3的樣品，稀釋8倍制備成溶液A和含相同供試品濃度并含內毒素為λ0.25EU/ml的溶液B，依法檢查，結果B液回收率均在50-200%，符合要求。

3.2.4 對6批產品生產過程中間產品取樣檢查

在原輔料、注射用水、氣體、生產環(huán)境等排查合格的基礎上，對生產過程中的中間產品取樣，比濁法進行細菌內毒素檢查，結果如下。

以上結果可以看出，采用比濁法對生產過程中的細菌內毒素進行檢測，結果量化更直觀，除菌過濾工藝雖能去除一部分內毒素，但效果不好；該研究產品采用100℃濕熱消毒法，雖不能達到F0值大于12的嚴格意義上的滅菌，但加熱法相比除菌過濾法能更有效地降低內毒素。

總結：小容量注射劑對細菌內毒素的控制應嚴格按照GMP的要求，在生產中進行全方位動態(tài)化內毒素定量控制，了解產品的原始內毒素負荷，生產環(huán)境和人員等過程負荷狀況等，以確保產品穩(wěn)定性，符合設計要求，提高產品質量。

參考文獻

[1]蔣顯利.大容量注射劑（大輸液）生產過程中細菌內毒素的控制[J].今日健康，2015（14）：9.

[2]胡文濱.無菌產品細菌內毒素的控制[J].河北省科學院學報，2010（27）：4.

[3]張娟等.動態(tài)濁度法測定阿奇霉素中細菌內毒素含量[J].中國藥學，2014（22）：112.

[4]祝清芬等.動態(tài)濁度法測定多西他賽注射液中細菌內毒素的含量[J].中國藥房，2011（22）：1.