劉玉濤 凌清標 黃寶欽 吳學敏 王隆柏 周倫江

摘 要：【目的】研究O78血清型大腸桿菌對蛋雞的致病性，以及單甘油酯對蛋雞O78血清型大腸桿菌不同致病方式的保護效果，為綠色無抗養(yǎng)雞提供理論支撐和實踐經(jīng)驗?！痉椒ā繉Ω＝ㄊ∧畴u場分離的血清型O78禽源致病性大腸桿菌（APEC），采用口服、頸部皮下和氣管內(nèi)壁接種不同日齡的試驗雞，評價菌株的致病性，建立攻毒模型，然后評估以丙酸單甘油酯、丁酸單甘油酯為主要成分的水溶性液態(tài)添加物FraC34對雞大腸桿菌病的保護效果?！窘Y果】（1）12日齡海蘭蛋雞雄雛口服接種細菌3.0×109CFU·羽-1，可造成100%發(fā)病;但22日齡海蘭蛋雞雄雛分別口服接種細菌3.0×109CFU·羽-1和6.0×109CFU·羽-1時不發(fā)病。12日齡海蘭蛋雞雄雛頸部皮下接種細菌0.4×109CFU·羽-1，可造成70%的試驗雞發(fā)病，22日齡海蘭蛋雞雄雛氣管內(nèi)壁接種細菌1.5×109CFU·羽-1，可造成25%雞只發(fā)病;（2）在飲水中添加FraC34，早期可改善雞腸道健康，降低腸道對APEC的易感性，在飲水中添加2～3 L·m-3的FraC34，能夠顯著降低經(jīng)由口服途徑感染APEC造成的發(fā)病率和死亡率，還能夠降低經(jīng)氣管內(nèi)壁接種APEC所造成的死亡率，并且顯著降低發(fā)病率;當飲水添加3 L·m-3時，可以維持感染雞的日增重。【結論】雞O78血清型的APEC對幼雛具有極大的危害性，造成嚴重經(jīng)濟損失，而中大雛對該菌株具有一定的耐受性;養(yǎng)殖環(huán)節(jié)添加FraC34，對于雞感染APEC具有一定的保護作用，并且可以維持雞的生產(chǎn)性能，可替代部分抗生素的使用，達到較為理想的保護效果。

關鍵詞：禽致病性大腸桿菌;丙/丁酸單甘油酯;海蘭蛋雞;保護效果

中圖分類號：S 852.612文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）02-209-05

0 引言

【研究意義】大腸桿菌是一類廣泛存在于自然界，并能引起人和動物共同感染的重要人畜共患病病原，依其致病機制可分為3類：共生型、腸內(nèi)致病型和腸外致病型。腸外致病型大腸桿菌（Extraintestinal Pathogenic E.coli， ExPEC）是定植于宿主腸道外其他組織、并嚴重致病的一類新的大腸桿菌菌群，是一類危害嚴重的人獸共患病病原，可分為尿道致病性大腸桿菌（UPEC）、腦膜炎/敗血癥相關大腸桿菌（MNEC）和禽致病性大腸桿菌 （APEC） 等[1]。APEC對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的危害，并且還可通過食物傳播;污染的飲水、食品會引起疾病暴發(fā)流行，因此也是一種重要的食源性病原[2-3]。APEC可通過其特有的毒力因子，如黏附素（P和S型菌毛、1型菌毛和Afa/Dr黏附素）、毒素（溶血素和細胞毒性壞死因子1）、表面抗原（K1、K5和K12莢膜和脂多糖）、侵襲素、離子攝取系統(tǒng)和分泌系統(tǒng)，侵襲、定殖于胃腸外組織，規(guī)避或破壞宿主防御機制，并誘發(fā)感染[4-5]，引起雞的心包炎、肝周炎、氣囊炎、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、臍炎、眼炎等疾病，對養(yǎng)雞業(yè)危害嚴重。目前隨著養(yǎng)雞業(yè)工廠化、標準化、集約化，飼養(yǎng)密度也隨之增加，APEC的發(fā)病率呈上升態(tài)勢，因此研究APEC的主要致病途徑和安全用藥意義重大。【前人研究進展】APEC血清型眾多，但O78血清型是福建省APEC優(yōu)勢血清型，流行率超過50%[6]，具有廣泛的代表性。最近幾十年，養(yǎng)殖業(yè)飼用抗生素的大量長期添加使用，影響了自然界均衡的微生物環(huán)境，造成病原的適應性變異和細菌耐藥性增加，也導致動物自身免疫下降、疾病頻發(fā)和采食量減少，并對人類健康造成威脅[7]，因此禁止將抗生素作為飼料添加劑在食品動物飼料中添加使用已成為世界各國政府和學者的共識與必然趨勢，歐盟于2006年全面禁止抗生素作為飼料添加劑使用，我國農(nóng)業(yè)部也已在2017年全面禁止硫酸黏桿菌素作為飼料添加劑使用，并且開始對其他抗生素啟動再評估工作，因此尋找安全有效的飼用抗生素替代品已成為全球研究的熱點。目前主流的抗生素替代品有益生菌、酸化劑、中草藥、植物提取物等種類[8]。單硬脂酸甘油酯多年來被作為乳化劑、膨松劑廣泛應用于食品及醫(yī)藥工業(yè)[9]，具有延長食品保存期的作用，無論是短鏈、中鏈，還是長鏈脂肪酸單甘酯，都具有一定的抗菌或抑菌活性。已有試驗表明甘油酯類物質也具有替代抗生素的功能，NAMKUNG H等研究證實單丁酸甘油酯對傷寒沙門氏菌Salmonella Typhimurium和產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens具有抗菌活性[10]，張希等通過體外抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)中鏈飽和脂肪酸單甘油酯對致病性大腸桿菌（Escherichia Coli） O157：H7和白色念珠菌Candida albicans具有較強的抑菌活性[11]?！颈狙芯壳腥朦c】前人對APEC的研究多集中在流行病學、病原鑒定，以及抗生素、中草藥和益生菌等對APEC的防治效果，有關福建省APEC的優(yōu)勢血清型O78的致病方式鮮見報道;另一方面，甘油酯作為一種新型制劑，前人研究多為體外抑菌試驗，鮮見針對感病蛋雞在臨床應用方面的研究?！緮M解決的關鍵問題】本試驗通過評價血清型O78 APEC的致病性，建立攻毒模型，然后通過添加FraC34（商品名：艾希托，以丙酸單甘油脂、丁酸單甘油酯為主要成分），觀察FraC34對雞致病性大腸桿菌病的防治效果，以期為綠色無抗養(yǎng)雞提供必要的理論支撐和實踐經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

APEC：2012年分離自福建省某雞場的典型大腸桿菌病例，經(jīng)鑒定血清型為O78，用該菌株37℃、20 h營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，接種4日齡海蘭蛋雞雄雛0.2 mL·只-1，致死率為100%，平均死亡時間為15.25 h，具有很強的致病力。試驗菌株接種到營養(yǎng)肉湯內(nèi)，置于搖床，37℃培養(yǎng)18～20 h，計算試驗菌液的菌落單位數(shù)（CFU），在使用時根據(jù)試驗需求用新鮮營養(yǎng)肉湯稀釋使用。

1.2 供試材料

FraC34，由佰高威盛（上海）動物藥業(yè)有限公司提供，黃棕色黏稠液體，主要成分為：丙酸單甘油脂≥ 31%，丁酸單甘油酯≥ 8%，丙酸鈉≥ 3%。

1.3 試驗動物及APEC致病性

試驗動物為海蘭蛋雞1日齡健康公雛，由福州農(nóng)工商種禽公司提供。試驗雞隔離飼養(yǎng)于動物房，1～5日齡，在飲水中添加電解多維，飼養(yǎng)至7日齡，而后進行分組，每組20只雞，分2個單元，每個單元10只雞。試驗雞均飼養(yǎng)于相同環(huán)境中，由專人管理，經(jīng)不同途徑接種（表1）后，于每日7∶00～22∶00時段，每隔3 h觀察1次，至接種后第7 d，觀察臨床表現(xiàn)，記錄死亡情況，并做好病死雞的剖檢記錄。同時設營養(yǎng)肉湯對照和不接種對照，各20只雞。人工感染后第8 d將全部幸存雞撲殺，剖檢觀察其病變，出現(xiàn)典型大腸桿菌病病變的雞，視為發(fā)病雞，合并計入發(fā)病數(shù)，并在平均死亡時間項目中進行加權。必要時做細菌分離培養(yǎng)。

1.4 單甘油酯保護效果

FraC34效果評估試驗共設A、B、C、D、E、F 6個處理;A1組、B1組分別于6日齡在飲水中投以1.0、1.5 L·m-3的FraC34，C1組、D1組分別于12日齡在飲水中投以2.0、3.0 L·m-3的FraC34，E1組、F1組只投喂清水作為對照?？诜臃N前停料2 h，停水1 h，口服攻毒后0.5 h再投喂飼料和飲水，A1、B1、C1、D1、E1組于12日齡通過口服接種3.0×109CFU的O78血清型雞大腸桿菌，F(xiàn)1組不攻毒，觀察7 d，記錄發(fā)病死亡情況，在19日齡試驗期結束時，對存活雞稱重，計算各組的平均體重。A2組、B2組分別于16日齡在飲水中投以1.0、1.5 L·m-3的FraC34，C2組、D2組分別于22日齡在飲水中投以2.0 、3.0 L·m-3的FraC34，E2組、F2組只投喂清水作為對照，A2、B2、C2、D2、E2組于22日齡通過氣管內(nèi)壁接種1.5×109CFU的O78血清型雞大腸桿菌，F(xiàn)2組不攻毒，觀察7 d，記錄發(fā)病死亡情況，在29日齡試驗期結束時，對存活雞稱重，計算各組的平均體重。

2 結果與分析

2.1 O78不同接種途徑對蛋雞的致病性

O78菌液經(jīng)口服、頸部皮下、氣管內(nèi)壁接種海蘭蛋雞雄雛，均可以造成試驗雞發(fā)病和死亡。在口服接種時，當12日齡接種3.0×109CFU·羽-1的菌液，可造成試驗雞100%的發(fā)病，并且死亡率達30%，而當22日齡接種時，接種同樣劑量或更高劑量的菌液，試驗雞未出現(xiàn)發(fā)病病例和死亡;當通過頸部皮下接種12日齡試驗雞時，造成70%的發(fā)病率;通過氣管內(nèi)壁對22日齡試驗雞接種菌液1.5×109CFU·羽-1時，其發(fā)病率可達到25%，死亡率為5%（表1）。

2.2 FraC34對感染蛋雞的保護效果

2.2.1 FraC34對12日齡蛋雞口服接種O78的保護效果

結果顯示，當在飲水中添加FraC34時，能夠降低由口服感染APEC所造成的發(fā)病死亡率，且A1B1C1D1組的日增重均好于陽性感染E1組，尤其FraC34在2.0～3.0 L·m-3的添加量時能夠顯著降低發(fā)病率和死亡率（表2）。

2.2.2 FraC34對22日齡蛋雞氣管壁接種O78的保護效果

在22日齡時，每只雞通過氣管內(nèi)壁接種1.5×109CFU的O78血清型APEC，7 d后觀察，結果顯示（表3），當水中添加2.0～3.0 L·m-3的FraC34時，能夠顯著降低由氣管內(nèi)壁接種感染APEC所造成的發(fā)病死亡率，且在3.0 L·m-3時，F(xiàn)raC34可以維持較好的日增重。

3 討 論

APEC作為腸外致病性大腸桿菌，可造成雞腸外組織感染導致死亡[11]。本研究對臨床分離的一株血清型為O78的APEC菌株通過接種途徑進行毒力評價。通過口服、頸部皮下注射、氣管內(nèi)壁接種該APEC菌株，均可以造成試驗雞的發(fā)病死亡和腸外組織感染，具有很強的致病性。接種的試驗雞，20 h之內(nèi)死亡的病雞，一般多無特征性病變，偶爾見到肌肉、肺臟、腎臟的充血出血。心包炎出現(xiàn)的時間一般在接種菌液22 h之后;肝周炎出現(xiàn)的時間稍遲，一般在38 h之后;氣囊炎造成的肉眼可見的混濁病變，一般出現(xiàn)在接種菌液100 h之后。

口服接種所需的菌液劑量較大，且隨著日齡增加，APEC的致病力下降，表明22日齡的海蘭蛋雞雄雛的腸道黏膜屏障功能完整，可以抵御強致病性大腸桿菌的攻擊;頸部皮下接種所需菌液劑量較小，并且具有很高的發(fā)病率和死亡率，死亡時間短;氣管內(nèi)壁接種22日齡雞，與口服接種相比，也可以造成一定的發(fā)病率（25%）和死亡率（5%），因此雞感染APEC的嚴重程度因感染日齡、感染量、感染途徑的不同而出現(xiàn)明顯的差異，在養(yǎng)殖過程中，一定要降低雞舍的粉塵和氨氣，避免外傷，可減少APEC的感染和發(fā)病率。

丙酸單甘油脂和丁酸單甘油酯作為FraC34的主要有效成分，在維護腸道黏膜屏障功能的完整性和抵御腸道有害致病菌方面起到重要的作用[12]，如能夠抑制和殺滅腸道有害菌APEC，維護黏膜完整性，降低APEC經(jīng)由腸道感染雞的風險。因此，本試驗在飲水中添加FraC34，可以降低APEC感染引起的發(fā)病率和死亡率，尤其在2～3 L·m-3劑量時，能夠顯著降低雞經(jīng)由口服感染APEC所造成的發(fā)病和死亡。此外FraC34具有維護腸道黏膜完整性的作用，還可以改善感染APEC肉雞的日增重，彌補由于感染引起的生長性能降低。

APEC的另一個重要感染途徑是經(jīng)由呼吸道感染，2～3周齡以上的雞只以呼吸道感染為主[13]，雖FraC34的體內(nèi)代謝途徑目前還不明確，但本試驗通過氣管內(nèi)壁接種O78血清型APEC，發(fā)現(xiàn)FraC34在較高濃度時對APEC感染具有保護作用，當在飲水中添加2.0～3.0 L·m-3時，可以較好地控制發(fā)病率和死亡率，尤其發(fā)病率顯著降低，并且添加3.0 L·m-3時，可以維持較好的日增重，有助于改善體況，因此FraC34不僅具有改善腸道健康的作用，在雞體內(nèi)還發(fā)揮著全身性的作用，從而改善部分由于呼吸道疾病引起的損失。

通過本研究結果表明：本實驗室臨床分離的優(yōu)勢血清型O78APEC菌株為強致病性菌株，可以作為研發(fā)生物制品的候選菌株，亦可以成為動物保健產(chǎn)品有效性評估的攻毒菌株。此外，通過不同途徑接種的致病結果提示，在養(yǎng)殖過程中需要加強管理，避免呼吸道感染和外傷感染APEC，可降低APEC的發(fā)病率和死亡率，提高養(yǎng)殖效益。同時在2周齡之前的雛雞飲水中添加2.0 L·m-3的FraC34和2周齡之后的中大雞在飲水中添加3.0 L·m-3的FraC34，可以降低經(jīng)由腸道和呼吸道感染APEC所造成的發(fā)病率和死亡率，并且在一定程度上還可以維持較好的日增重，增加經(jīng)濟效益。通過本研究對FraC34在APEC感染雞的效果評估試驗，說明FraC34在替代抗生素治療雞的部分細菌病方面具有一定的潛力和效果，可以作為抗生素替代品用于雞的細菌病的防控，減少抗生素使用。

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（責任編輯：翁志輝）