王長文 王忠 王錦鋒 吳鴻雪

摘?要：蟲草素是蛹蟲草中重要的生物活性之一，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫力等生物功效，目前主要從蛹蟲草相關(guān)培養(yǎng)物中提取蟲草素。從蟲草素的藥理作用、提取、分離純化、測定以及優(yōu)化蟲草素的產(chǎn)量方面進(jìn)行綜述，總結(jié)蛹蟲草蟲草素研究進(jìn)展，并進(jìn)行相關(guān)展望。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草;蟲草素;藥理作用;提取純化;產(chǎn)量

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.02.019

Abstract： Cordycepin is one of the important biological activities in cordyceps militaris， with the biological effects of antitumor， antiinflammation， antibacterial， antivirus and improving immunity. At present， cordycepin is mainly extracted from cordyceps militarisrelated cultures. In this paper， the pharmacological effects， extraction， separation， purification， determination and optimization of cordycepin production were reviewed. The research progress of cordycepin was summarized and the related prospects were prospected.

Key words： Cordyceps militaris; Cordycepin; Pharmacological effect; Extraction and purification; Yield

蟲草素Cordycepin又稱冬蟲夏草素、蟲草菌素、蛹蟲草菌素，是一種腺苷類物質(zhì)。別稱3′脫氧腺苷（3′deoxyadenosine），分子量為251 D，分子式組成為C10H13N5O3 ，紫外光的最大吸收波長為259 nm[1-2]。蟲草素最早是在蛹蟲草的培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)并定名[3]。蟲草素既可以溶于水也可以溶于甲醇和熱乙醇，但不溶于苯、乙醚、氯仿[4]。蟲草素作為研究對象一直以來受到國內(nèi)外學(xué)者的極高關(guān)注。本文對蟲草素的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1?蟲草素的藥理作用

1.1?抗腫瘤作用

蟲草素作為蟲草的主要生物活性之一，大量的試驗(yàn)研究證實(shí)，蟲草素具有抗腫瘤作用，其對人的白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、人鼻咽癌KB細(xì)胞、宮頸癌HeLa細(xì)胞、肉瘤S180、Lewis肺癌、鼠的B16BL6黑素瘤細(xì)胞等均能產(chǎn)生明顯的抑制作用[5-11]。因此，蟲草素可作為抗腫瘤藥物的一種開發(fā)方向，且蟲草具有較高的天然安全性。

1.2?免疫調(diào)節(jié)作用

近些年有很多試驗(yàn)研究證實(shí)，蟲草素具有免疫調(diào)節(jié)功能。有研究指出，蟲草素能顯著提高人外周血單核細(xì)胞IL10的分泌，同時(shí)會抑制IL2的分泌，表明其具有免疫調(diào)節(jié)作用[12]。此外也有報(bào)道蟲草素可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化[13]。

1.3?抗菌、抗病毒作用

蟲草素作為核苷類物質(zhì)，對細(xì)菌、真菌、病毒等微生物的代謝有多重作用。有人研究了蟲草素對侵入型念珠菌具有抗真菌活性[14]。此外有大量的報(bào)道表明，蟲草素對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、炭疽桿菌等[15-16]均有抑制作用;對白血病病毒宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化有抑制作用;對人類皰疹病毒、腦膜炎病毒、HIV1型病毒等亦有殺傷抑制作用[17-18]。蟲草素作為一種廣譜抗生素引起國內(nèi)外研究者的高度重視。

1.4?其他作用

有部分研究指出，蟲草素具有抗炎癥作用。有研究表明，蟲草素從某些方面可以干擾炎癥發(fā)生機(jī)制，從而抑制炎癥反應(yīng)[19-20]。另外，蟲草素還具有溶血栓[21]的功效，調(diào)節(jié)血管壁[22]、抑制血小板凝集[23];蟲草素對布魯錐蟲有治療效果[24]。

2?蟲草素提取方法

當(dāng)前蟲草素獲取的途徑主要有2種：一種是生物合成途徑，是由蛹蟲草相關(guān)培養(yǎng)中提取，包括子實(shí)體、菌絲體及發(fā)酵液;二是人工化學(xué)方法合成。對于蟲草素人工化學(xué)合成技術(shù)，國內(nèi)外早有相關(guān)研究報(bào)道，但合成過程復(fù)雜，可重復(fù)操作性困難，原料、設(shè)備投入成本高、產(chǎn)率低[25]，且在合成過程中用到的大量有機(jī)溶劑會對環(huán)境造成不良影響，工業(yè)化生產(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)。

蟲草素提取方法主要有浸提法、滲漉法、超聲法、索氏提取法、回流法及超臨界萃取等。凌建亞等[26]比較其中4種方法對蟲草素提取的影響。結(jié)果表明：浸提法耗時(shí)長且提取效果一般，不利于下一步試驗(yàn)進(jìn)行。而分別調(diào)整回流提取、索氏提取及超聲法提取的作用時(shí)間均得到相近結(jié)果。但采取超聲法提取更快捷、簡便，受外界干擾小，同時(shí)可減少回流前后稱重、補(bǔ)足溶劑定容所帶來的誤差。

陳偉等[27]分別利用水、乙醇、甲醇作為提取劑提取蛹蟲草子實(shí)體干粉中的蟲草素，對比發(fā)現(xiàn)蒸餾水是最佳溶劑。常見的把超聲、微波、酶法等作為輔助提取手段。張嘉等[28]利用水熱回流法、醇熱回流法、超聲水提法、超聲波醇提法進(jìn)行試驗(yàn)，研究表明超聲波醇提法提取率最高，確定的最佳提取工藝為75%乙醇超聲波提取3次、每次40 min、料液比1∶20。夏敏等[29]利用微波法提取蟲草素并用HPLC法測定其含量，微波法提取的最佳工藝為提取液10 mL、料液比1∶200、中火處理3 min，樣品中蟲草素測量值達(dá)12.16 mg·g-1，且比超聲波法提取率高。殷東林等[30]以蛹蟲草子實(shí)體干粉為材料，提取劑為70%乙醇，然后通過正交試驗(yàn)進(jìn)一步研究，最終確定的最佳工藝為微波功率350 W、處理4 min、提取2次、料液比1∶50，提取率高達(dá)6.87%。張鳳清等[31]選用北冬蟲夏草子座為材料進(jìn)行蟲草素提取，結(jié)果顯示超高壓萃取效果最佳，其工藝為壓力500 MPa、容積體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶75、提取時(shí)間2 min，提取率達(dá)到5.5

mg·g-1。

3?蟲草素分離純化

自Cunningham[3]在1951年用活性炭和交換樹脂首次分離出蟲草素以來，各種分離方法不斷涌現(xiàn)，各有利弊，不斷發(fā)展。目前常用的蟲草素分離純化方法有多種，其中比較高效的方法有超臨界萃取法、離子交換樹脂吸附法、大孔吸附樹脂法。

離子交換樹脂吸附法關(guān)鍵在于選擇合適的離子交換樹脂。車振明等[32]用732NH4+型陽離子交換樹脂提取，但提取的蟲草素得率較低，只有81%。毛寧等[33]采用JK006陽離子與717陰離子交換樹脂相配合，得到純度達(dá)96.4%的蟲草素。

大孔樹脂的選擇要與目的成分極性相似[34]。曾昱等[35]利用大孔吸附樹脂法，填料XAD16樹脂，得到的蟲草素純度達(dá)到98%以上。劉艷芳等[36]采用NKAII型大孔樹脂分離蟲草素，反復(fù)結(jié)晶得純度達(dá)98%以上。李學(xué)軍等[37]采用ML7大孔樹脂純化蟲草素純度可達(dá)到92%以上。

此外，超臨界萃取技術(shù)發(fā)展迅速，陳順志等[38]利用超臨界萃取技術(shù)以蛹蟲草人工培養(yǎng)后的發(fā)酵物為原料，獲得的蟲草素晶體純度為50.0%～99.9%，該技術(shù)無污染，易操作，但成本高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

蟲草素分離純化方法有多種，每種方法各有利弊，可多種方法聯(lián)用。徐文豪等[39]采用離子交換樹脂、大孔吸附樹脂處理和多次硅膠柱層析、薄層分離法得到核苷類物質(zhì)，蟲草素是核苷類物質(zhì)的一種，因此也可用于蟲草素分離[40]。

4?蟲草素測定

蟲草素作為一種生物活性物質(zhì)，測定含量的方法有多種。目前主要的測定方法有高效液相色譜法（HPLC）、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）、薄層色譜法（TLCS）、TLCSHPLC聯(lián)用法。其中最常用的是高效液相色譜法（HPLC），精密度與準(zhǔn)確度高，一般采用反相色譜法，以十八烷基鍵合硅膠為固定相，流動相有多種，采用C18填料的色譜柱，填料粒為5 mm，柱子直徑4.6 mm，柱子長為150 mm和250 mm，流動相為甲醇、水或甲醇、磷酸緩沖液，檢測波長為254、259和260 nm，檢測溫度為20～40℃，柱流速為0.5～1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量5～20 L[41]。

5 ?蟲草素產(chǎn)量提升優(yōu)化

5.1?高產(chǎn)菌種的選育

提高蟲草素含量非常重要的措施之一就是獲得穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)菌株。據(jù)現(xiàn)有的研究報(bào)道，蛹蟲草菌種選育的方法主要有化學(xué)試劑誘變、輻射誘變等。

Das等[42]采用高能離子束誘變蛹蟲草，獲得比對照組高72%的突變株。劉金彬等[43]利用離子束、亞硝基胍及離子束亞硝基胍誘變法處理蛹蟲草Cordyceps militaris JN168，獲得幾株較高產(chǎn)菌株，每組誘變都能提高蟲草素產(chǎn)量，最后獲得的復(fù)合誘變菌2，經(jīng)過優(yōu)化液體發(fā)酵，產(chǎn)量提高了5倍，高達(dá)1045.65 mg·L-1。曹照平等[44]用蛹蟲草FFCC5111 為出發(fā)菌株，通過 200 W 、22 kHz超聲強(qiáng)度聯(lián)合1% DES 復(fù)合誘變獲得突變株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，突變株FFCC5111c 產(chǎn)生的蟲草素比親株提高44.5%，高達(dá)4.142 g·L-1。此外，溫魯?shù)萚45]研究航天搭載蛹蟲草進(jìn)行誘變，蟲草素產(chǎn)量比原始株提高了2.5倍。

5.2?優(yōu)化培養(yǎng)條件

當(dāng)前蟲草素的生物合成途徑主要有2種：一種是固體培養(yǎng)的子實(shí)體中提取，但蟲草素含量一般只有0.5%左右或者更低[46]，因此難以滿足市場需求。二是菌絲發(fā)酵液中提取，97%～98%的蟲草素分泌在發(fā)酵液中，且液體發(fā)酵周期短，產(chǎn)量較子實(shí)體中高。

秦鵬等[47]利用響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草液體發(fā)酵條件，得出蟲草素積累量達(dá)到852.621 μg·mL-1，其優(yōu)化培養(yǎng)條件：KNO3 0.04 g、酵母浸膏1.50 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、KH2PO4 0.2 g·mL-1、葡萄糖3.82 g、ZnSO4·7H2O 0.06 g、MgSO4·7H2O 0.13 g、維生素B1 0.08 g，（含量均是按100 mL計(jì)）;同等條件下，發(fā)酵8 d、靜置10 d后，蟲草素積累量高達(dá)936.225 μg·mL-1。湯佳鵬等[48]研究蛹蟲草表面液體發(fā)酵結(jié)果表明組合使用0.55 mg·L-1三十烷醇、22.64 mg·L-1 赤霉素與 1.69 mg·L-1 ?6芐基腺嘌呤的組合是最有利于蟲草素積累的組合，蟲草素最大產(chǎn)量達(dá)到 7.31 g·L-1。閆瑞等[49]研究在蛹蟲草FFCC5111液體發(fā)酵添加前體物，結(jié)果表明，添加腺苷、苯丙氨酸、腺嘌呤、甘氨酸和L谷氨酰胺均可提高蟲草素產(chǎn)量，其中添加腺苷1.5 g·L-1的發(fā)酵液中蟲草素產(chǎn)量最高，為772.5 mg·L-1，是對照組的9.39倍。據(jù)秦鵬、王龍等[50]的專利，利用腺嘌呤補(bǔ)料公式配比補(bǔ)料發(fā)酵液，其優(yōu)化配方：葡萄糖35 g、蛋白胨17 g、腺嘌呤2 g、甘氨酸14 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 1 g、pH值自然，制得發(fā)酵濾液蟲草素產(chǎn)量達(dá)到 956.020 μg·mL-1，對照提高了535.66%。Masuda等[51]在基本培養(yǎng)基中加入1 g·L-1腺嘌呤和16 g·L-1氨基乙酸，使得蟲草素產(chǎn)量提高了4.1倍。陳長蘭等[52]分析了蛹蟲草液體搖瓶過程中分別添加20種含量0.2 g·100-1 mL的氨基酸，結(jié)果表明精氨酸、組氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸及丙氨酸的添加對蟲草素產(chǎn)量增加。周思靜等[53]研究在蛹蟲草液體培養(yǎng)基中加入金屬離子，結(jié)果表明添加Mn2+、Ca2+、Mg2+能夠顯著（P<0.05）提高蛹蟲草液體培養(yǎng)胞外蟲草素產(chǎn)量，最適濃度分別是0.05、0.6、1.0 g·L-1。阮元等[54]研究了添加不同濃度的維生素B1、B6和2，4D到常規(guī)培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示中維生素B1和B6 的最佳添加濃度均為 0.83 g·L-1，2，4D 的最佳添加濃度為 0.015 mg·mL-1，此外還對比了滅菌前、后各添加維生素 B1，發(fā)現(xiàn)滅菌前的比滅菌后的蟲草素產(chǎn)量提高了19.9%。表明維生素B1的分解產(chǎn)物對蟲草素合成有促進(jìn)作用。蔡水淋等[55]通過設(shè)計(jì)優(yōu)化蛹蟲草液體深層發(fā)酵工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無機(jī)鹽FeSO4對蟲草素產(chǎn)量影響最顯著。

6?總結(jié)與展望

現(xiàn)代研究已表明，蟲草素具有多重藥理作用，包括抗菌、消炎、抗腫瘤、抗病毒、提升人體免疫力等功效，因此，在食品、醫(yī)藥、保健品等方面都有著巨大的開發(fā)價(jià)值和廣闊的市場前景。蟲草素自被發(fā)現(xiàn)有特殊的功效以來，引起國際上的專家學(xué)者的極大關(guān)注，對其研究也是多方面的，包括有提取制備、生物活性、藥用價(jià)值、作用機(jī)理以及開發(fā)應(yīng)用等[25]。蟲草素提取制備主要研究高效的提取方法，以期更多的產(chǎn)量和更高的純度。蟲草素療效顯著，但大量分離獲得純品比較困難，導(dǎo)致市場蟲草素價(jià)格非常昂貴。蟲草素的合成途徑復(fù)雜，目前的研究報(bào)道絕大多數(shù)是利用生物合成途徑，主要以發(fā)酵菌絲的方式來獲取。但是以傳統(tǒng)的方法發(fā)酵菌絲蟲草素產(chǎn)量低下，不能滿足市場需求。因此，優(yōu)化培養(yǎng)發(fā)酵條件，縮短周期，獲得更高產(chǎn)的產(chǎn)蟲草素的培養(yǎng)方式是將來發(fā)展的方向。市場上有著很多蟲草素開發(fā)的產(chǎn)品，只要是對人類健康有益的都會被接受，有重要的社會意義。總之，蟲草素的研究與開發(fā)已取得喜人的成就，隨著技術(shù)發(fā)展會有更廣闊的市場前景。

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（責(zé)任編輯：劉新永）