張磊　何越峰　張莉　張騰飛　楊凱云　黃云超　譚慧

[摘要] 目的 探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）DEANR1、INXS、ANCR、FENDRR等在肺癌中的表達(dá)。 方法 選取2018年1～6月昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治的54例肺癌患者，其中鱗癌、腺癌、肺小細(xì)胞癌分別為28、22、4例。經(jīng)手術(shù)獲取癌組織、癌旁正常組織、肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，提取總RNA，并采用SYBR Green實(shí)時熒光定量PCR檢測基因的RNA表達(dá)量。 結(jié)果 DEANR1、INXS、ANCR在癌組織中的相對表達(dá)量均高于癌旁正常組織（P < 0.05）。淋巴結(jié)組織中ANCR、INXS的相對表達(dá)量與ki-67呈正相關(guān)（r = 0.757，P = 0.049;r = 0.802，P = 0.030）。結(jié)論 DEANR1、INXS、ANCR在癌組織中的相對表達(dá)量均升高，可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)作用，ANCR、INXS在淋巴結(jié)中的表達(dá)與ki-67呈正相關(guān)，可能與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 肺癌;lncRNA;DEANR1;INXS;ANCR;FENDRR

[中圖分類號] R734.2 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）06（c）-0009-03

Expression of long non-coding RNA DEANR1 and others in lung cancer

ZHANG Lei1 ? HE Yuefeng2 ? ZHANG Li1 ? ZHANG Tengfei1 ? YANG Kaiyun1 ? HUANG Yunchao1 ? TAN Hui1

1.The First Department of Thoracic Surgery， the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming ? 650500， China; 2.School of Public Health， Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming ? 650500， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of long non-coding RNA （lncRNA） DEANR1， INXS， ANCR， FENDRR in lung cancer. Methods The study included 54 patients with lung cancer admitted to the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University from January to June 2018， including squamous cell carcinoma， adenocarcinoma， and small cell lung cancer in 28， 22， 4 cases， respectively. The cancer tissue， the lymph node metastasis and the tissue adjacent to carcinoma of 54 cases of patients with lung cancer was used to detect the expression of these genes by the real-time fluorescence quantitative PCR. Results The expression levels of INXS and ANCR in cancer tissues were higher than those in adjacent normal tissues （P < 0.05）. The expression levels of ANCR and INXS in lymph node tissues were positively correlated with ki-67 （r = 0.757， P = 0.049; r = 0.802， P = 0.030）. Conclusion The increased expression of DEANR1， INXS and ANCR in cancer tissues may be a positive factor in the development of lung cancer. The expression of ANCR and INXS in lymph nodes is positively correlated with ki-67， which may be related to lymph node metastasis and poor prognosis of lung cancer.

[Key words] Lung cancer; lncRNA; DEANR1; INXS; ANCR; FENDRR

肺癌在世界上發(fā)病率及死亡率一直居高不下，其發(fā)生發(fā)展與多個基因的表達(dá)密切相關(guān)，長鏈非編碼RNA（lncRNA）指的是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt[1]但不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中有異常的lncRNA表達(dá)譜，其表達(dá)和功能的異常經(jīng)常導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等[2-4]。

有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA DEANR1在調(diào)節(jié)內(nèi)胚層分化中有重要作用[5]。文獻(xiàn)[6]發(fā)現(xiàn)INXS在腎臟、肝臟、乳腺和前列腺腫瘤細(xì)胞系中含量比非腫瘤組織低5～9倍，揭示了INXS是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性lncRNA。在一項關(guān)于乳腺癌的研究中，發(fā)現(xiàn)ANCR基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)較癌旁組織下調(diào)，ANCR抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和入侵，該基因可能是乳腺癌診斷及治療的標(biāo)志物[7]。研究發(fā)現(xiàn)FENDRR能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NSCLC）的惡性增殖[8]。肺癌作為人類死亡率最高的惡性腫瘤，筆者推測其中部分基因也可能與肺癌的增殖、凋亡、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等某個方面相關(guān)。

本研究納入2018年1～6月昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的54例肺癌患者，經(jīng)手術(shù)獲取標(biāo)本，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測肺癌組織、正常組織、縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中DEANR1、INXS、ANCR、FENDRR基因的表達(dá)量，通過與臨床觀察指標(biāo)綜合分析，觀察其與肺癌的發(fā)生發(fā)展是否有關(guān)，為下一步研究lncRNA基因譜與肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制奠定一定的實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書后，收集2018年1～6月我院胸外一科住院患者行外科手術(shù)切除的肺癌組織、癌旁正常組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織（正常組織與癌組織距離>3 cm），均經(jīng)過病理確診。術(shù)后組織細(xì)胞學(xué)病檢結(jié)果出示后，確定組織分型，查詢并收集病例資料。共收集樣本54例，其中腺癌、鱗癌、小細(xì)胞癌分別為28、22、4例;年齡35～75歲，平均（55.86±8.67）歲;男38例，女16例;吸煙33例，占61.11%;飲酒22例，占40.74%;低、中、高分化程度分別為26、22、6例;P40有10例（-）、11例（+）;P63有15例（-）、12例（+）;TTF-1有15例（-）、13例（+）;CK7有10例（-）、11例（+）;ki-67（+）范圍為1%～80%。

納入標(biāo)準(zhǔn)：肺腫瘤患者經(jīng)手術(shù)后取得組織學(xué)標(biāo)本經(jīng)病理確診為鱗癌、腺癌或小細(xì)胞肺癌。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①肺腫瘤患者不能行手術(shù)者;②手術(shù)未能同時獲得癌組織、正常組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織。

1.2 組織的收集和保存

取下組織10 min內(nèi)將標(biāo)本放入預(yù)先裝有RNAlater（美國ambin公司，貨號JC-009）溶液的試管內(nèi)，先在 -4℃環(huán)境中放置8 h，然后放入-80℃冰箱內(nèi)長期保存。

1.3 RNA提取和定量

利用TRIzol（康為世紀(jì)）提取總RNA，天根生化Quant One Step RT-PCR kit（KR113）（貨號CW2569M）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按說明書步驟操作。利用熒光定量檢測試劑盒（FP402）（天根生化，貨號CW0957M）對RNA進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，以β-actin作為內(nèi)參，以-△△Ct值來表示組織中各個基因相對表達(dá)量。引物信息見表1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計數(shù)據(jù)后錄入數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行三組之間的比較，使用LSD-t檢驗來比較任意兩組間的差異，5個基因相對表達(dá)量與ki-67的關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)，與P63、CK-7等相關(guān)性采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織、癌旁正常組織與肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)

與正常組織比較，肺癌組織中DEANR1、INXS、ANCR的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 基因的相對表達(dá)量與ki-67及CK-7、P63等臨床指標(biāo)之間的關(guān)系

在肺癌組織中，CK-7陽性組中ANCR、FENDRR相對表達(dá)量[（8.15±4.23）、（16.00±5.54）]顯著高于CK-7陰性組[（16.00±5.54）、（13.43±2.14）]（P = 0.032、 0.025）;DEANR1在P63陽性組的表達(dá)量（10.28±1.29）顯著高于P63陰性組（9.25±3.79）（P = 0.035）。通過Spearman等級相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)組織中ANCR、INXS的相對表達(dá)量與ki-67呈正相關(guān)（r = 0.757，P = 0.049;r = 0.802，P = 0.030）。

3 討論

lncRNA對癌癥等疾病具有重要的治療潛力，其結(jié)構(gòu)、表達(dá)是許多疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)[9]。目前，已有報道ANCR在骨肉瘤組織中高表達(dá)，ANCR的表達(dá)減少抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移[10]。在結(jié)直腸癌中，ANCR表達(dá)降低時，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力顯著下降[11]，但ANCR在肺癌中的作用尚不清楚。本研究中ANCR在肺癌組織中的表達(dá)高于正常組織（P < 0.05），在肺癌組織中ANCR在CK-7陽性組的表達(dá)量高于陰性組（P < 0.05），而CK-7在鱗狀上皮中并不表達(dá)，主要用于腺癌的診斷，ANCR的表達(dá)量與ki-67呈正相關(guān)，ki-67與預(yù)后相關(guān)，是檢測惡性腫瘤細(xì)胞增殖情況及惡性程度、判斷肺癌預(yù)后的標(biāo)志[12]。提示ANCR可能在肺癌的發(fā)生中起到癌基因的作用，并與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)，但其機(jī)制還需深入探索。

DEANR1在內(nèi)胚層分化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，但它是否在肺癌中發(fā)揮作用鮮見文獻(xiàn)報道。本研究中DEANR1在肺癌組織中的表達(dá)較正常組織高（P < 0.05），并且與免疫組化指標(biāo)P63有關(guān)，P63參與癌細(xì)胞增殖分化，同時具有促進(jìn)和抑制腫瘤生長兩種作用[13]，在肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中，P63陽性組的DEANR1表達(dá)量高于P63陰性組（P < 0.05），可能為今后本課題組進(jìn)一步研究DEANR1在肺癌中的作用奠定基礎(chǔ)。

INXS被發(fā)現(xiàn)是具有凋亡作用的新型內(nèi)源性lncRNA，其在腎臟、肝臟、乳腺和前列腺腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量比非腫瘤組織中低5～9倍，INXS可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性lncRNA[5]。本研究中，INXS在肺癌組織中的表達(dá)高于正常組織（P < 0.05），與上述研究不同，可能與組織來源不同有關(guān)，也可能其在肺癌細(xì)胞中發(fā)揮著不同的作用，但還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究，在淋巴結(jié)組織中INXS的表達(dá)量與ki-67呈正相關(guān)（P < 0.05），有研究發(fā)現(xiàn)ki-67的陽性與惡性腫瘤的增殖、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后高度相關(guān)[14]，與本研究結(jié)果一致，提示INXS可能與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)，是癌癥治療中可能探索的靶點(diǎn)。

在肺癌相關(guān)研究中，F(xiàn)ENDRR基因可能與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)，但與轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系[15]。本研究中，F(xiàn)ENDRR在各組織中的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但FENDRR在CK-7（+）組的表達(dá)量高于CK-7（-）組（P < 0.05），而CK-7陽性表達(dá)與乳腺、肺等組織腺癌的發(fā)生相關(guān)[16]，提示FENDRR可能與肺腺癌的發(fā)生有一定關(guān)系，但需進(jìn)一步收集肺腺癌樣本進(jìn)行研究。

綜上所述，本研究通過對肺癌組織、正常肺組織、肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中DEANR1、INXS、ANCR、FENDRR基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)DEANR1、INXS、ANCR在肺癌組織中的表達(dá)上調(diào)，上述基因可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)作用，ANCR、INXS在淋巴結(jié)中表達(dá)與ki-67呈正相關(guān)，可能與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)。上述基因的表達(dá)情況可為今后肺腫瘤的診斷、治療、預(yù)后評價提供新的思路。在今后的研究中，我們將擴(kuò)大樣本量，針對與肺癌相關(guān)的基因，對不同病理分型的肺癌進(jìn)行進(jìn)一步病因及機(jī)制相關(guān)的研究。

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