鄭祥亁 陳凌娜 孫茂盛 崔永忠 楊漢奇

(1 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所 昆明650233；2 西南林業(yè)大學(xué)竹藤研究所 昆明650233)

竹類植物是重要的林業(yè)種質(zhì)資源， 2017 年中國(guó)以竹筍和竹材為主的竹產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值達(dá)2 346 億元， 成為國(guó)民經(jīng)濟(jì)中一項(xiàng)重要的產(chǎn)業(yè)[1]。 優(yōu)質(zhì)種苗是農(nóng)林產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)。 傳統(tǒng)的竹子育苗技術(shù)多見于扦插、 分篼、 埋稈、 埋鞭等， 這些技術(shù)存在母竹消耗多、 成本高、 繁殖系數(shù)低等問題， 因此快速高效的快繁技術(shù)越來越多地在竹子育苗研究中得到應(yīng)用[2]。 目前，竹子的離體快繁技術(shù)已在多個(gè)散生和叢生竹種中取得成功[3-5]。

云南甜龍竹 (Dendrocalamus brandisii) 分布于緬甸、 越南、 老撾、 泰國(guó)以及中國(guó)云南中部和南部地區(qū)， 稈莖粗10～12 cm， 稈高10～15 m， 是優(yōu)良的筍材兩用大型叢生竹種， 其鮮食筍質(zhì)好， 具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]。 云南甜龍竹是云南栽種面積最廣的筍用竹之一， 常用埋節(jié)或埋稈法育苗， 但其效率低、育苗成本高， 2008 年種苗價(jià)格達(dá)到20 ～30 元/叢，而且苗木質(zhì)量不易控制， 極大地阻礙了該竹種的推廣栽培。 由于罕見開花結(jié)實(shí)， 目前云南甜龍竹的快繁技術(shù)僅見以嫩芽為外植體材料的報(bào)道， 且增值系數(shù)較低[7]。 本研究以云南甜龍竹種子為實(shí)驗(yàn)材料，通過探索不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)其種胚無(wú)菌苗的叢生芽誘導(dǎo)、 增殖及生根的影響， 建立其離體快繁體系， 為促進(jìn)云南甜龍竹種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、 顯著減低苗木成本提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年3 月在云南紅河州采集成熟云南甜龍竹種子， 剝?nèi)ワ?自然晾干， 選擇健康飽滿的種子于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

種子經(jīng)滅菌[8]后， 接種于以MS 為基本培養(yǎng)基并含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中， 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為不同濃度的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 和6-糠氨基嘌呤(KT)， 分別設(shè)置4 種濃度梯度， 即6-BA，1.0、 2.0、 3.0 和4.0 mg/L； KT， 0.3、 0.6、 0.9和1.2 mg/L。 首先比較2 種常用細(xì)胞分裂素6-BA和KT 對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)效果， 效果較好的6-BA 再與萘乙酸(NAA) 配合， 篩選最佳的濃度組合。 每個(gè)處理接種60 瓶， 每瓶接種2 粒種子， 重復(fù)3 次。

1.2.2 叢生芽增殖培養(yǎng)基的篩選

取長(zhǎng)勢(shì)和形態(tài)相似， 高約2.0 cm 的叢生芽， 分切為每2～3 個(gè)芽為一叢， 接種于含不同濃度水平的NAA、 6-BA、 噻苯隆(TDZ) 的MS 增殖培養(yǎng)基上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選適合叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基。 每種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑設(shè)置3 種濃度水平 (表1)， 每個(gè)處理接種45 瓶， 每瓶接種2 叢， 重復(fù)3 次。

1.2.3 試管苗生根培養(yǎng)基的篩選

將以上增殖的叢生芽(長(zhǎng)約3 cm) 轉(zhuǎn)接到含不同濃度的NAA、 吲哚丁酸(IBA) 及不同培養(yǎng)基的生根培養(yǎng)基上， 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳生根培養(yǎng)基。 每種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和基本培養(yǎng)基設(shè)置3 種濃度水平(表2)， 每個(gè)處理接種45 瓶， 每瓶接種2叢， 重復(fù)3 次。

表2 試管苗生根試驗(yàn)的各處理水平

1.2.4 培養(yǎng)條件

各階段培養(yǎng)基均含蔗糖30 g/L、 瓊脂6.5 g/L，pH 值為5.9～6.3， 在不同培養(yǎng)階段添加相應(yīng)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑， 培養(yǎng)環(huán)境為8 h 黑暗、 16 h 光照， 溫度(25±2) ℃， 相對(duì)濕度80%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

叢生芽誘導(dǎo)、 增殖、 生根情況均在接種21 d 后分別統(tǒng)計(jì)。 誘導(dǎo)率、 增殖倍數(shù)、 生根率等指標(biāo)按以下公式計(jì)算：

誘導(dǎo)率＝未污染且萌發(fā)叢生芽的種子數(shù)/ (接種種子總數(shù)-污染種子總數(shù)) ×100%；

增殖倍數(shù)＝增殖后芽苗的總數(shù)(＞0.5 cm) /接種時(shí)芽苗總數(shù)；

生根率＝生根苗數(shù)/ (接種苗數(shù)-污染苗數(shù)) ×100%。

數(shù)據(jù)分析由SPSS 17.0 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示(表3)， 6-BA 對(duì)云南甜龍竹種胚苗叢生芽誘導(dǎo)效果顯著高于KT， 并在濃度為3.0 mg/L 時(shí)誘導(dǎo)率最高， 為75.00%； 而KT 處理與對(duì)照沒有顯著性差異， 但經(jīng)KT 處理后的幼苗高生長(zhǎng)快，21 d 可達(dá)15 cm 左右， 而且節(jié)間較長(zhǎng)， 每節(jié)5 cm左右。

表3 不同濃度6-BA 和KT 處理的種胚苗叢生芽誘導(dǎo)率

將濃度為3.0 mg/L 的6-BA 與不同濃度的NAA組合處理無(wú)菌苗叢生芽， 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(表4)， 隨著NAA 濃度的提高， 叢生芽的誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。 NAA 濃度為0.7 mg/L 時(shí)叢生芽誘導(dǎo)率最高， 達(dá)86.33%， 且叢生芽長(zhǎng)勢(shì)良好。 因此， 云南甜龍竹叢生芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.7 mg/L。

表4 6-BA+NAA 組合對(duì)云南甜龍竹無(wú)菌苗叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叢生芽增殖的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示(表5)， 9 個(gè)處理的增殖倍數(shù)最小為4.33 (處理9)， 最大為4.86 (處理5)。 極差R 值顯示NAA、 6-BA、 TDZ 對(duì)叢生芽增殖的影響從大到小依次是： 6-BA＞NAA＞TDZ； 多重比較結(jié)果表明， NAA、 6-BA 處理中的水平1 和2 的叢生芽增殖倍數(shù)均顯著高于水平3； 而TDZ 對(duì)叢生芽增殖倍數(shù)的影響不顯著。 因此， 云南甜龍竹叢生芽增殖的最適培養(yǎng)基為MS + NAA 0.3 mg/L + 6-BA 6.0 mg/L +TDZ 0.001 mg/L。 以此培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 增殖倍數(shù)可達(dá)4.90， 且叢生芽的生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

表5 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的叢生芽增殖情況

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叢生芽生根的影響

由表6 可見， 各處理的生根率(去掉受污染的叢生芽) 最小為59.35% (處理9)， 最大為69.96%(處理5)。 極差R 值顯示， 6-BA 對(duì)其叢生芽生根率的影響最大， 其次是NAA， 而培養(yǎng)基的影響最小。 多重比較結(jié)果顯示， NAA、 IBA 處理中的水平1 和2 對(duì)叢生芽生根率的影響均顯著大于水平3， 而培養(yǎng)基對(duì)生根率的影響不顯著。 由此， 云南甜龍竹叢生芽生根的最適培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 2.0 mg/L +IBA 4.0 mg/L。 以此培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 其生根率為71.45%。

表6 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的叢生芽生根情況

3 結(jié)論與討論

種子是竹類組織培養(yǎng)研究中最便利的材料， 容易得到具有強(qiáng)分化能力和活力的胚性外植體材料[2]。本試驗(yàn)利用不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)基， 以實(shí)生無(wú)菌苗為外植體材料， 對(duì)云南甜龍竹的組培快繁技術(shù)進(jìn)行了全面研究。 在云南甜龍竹叢生芽誘導(dǎo)方面， KT 沒有明顯的促進(jìn)作用； 而6-BA 可以顯著地提高叢生芽的誘導(dǎo)效果， 隨著6-BA 濃度的升高，誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。 這與以云南甜龍竹新萌發(fā)的嫩枝為外植體[7]以及慈竹(Neosinocalamus affinis)[9]叢生芽誘導(dǎo)的結(jié)果相似。另外， KT 處理的幼苗其高生長(zhǎng)較快且節(jié)間較長(zhǎng)， 這可能與KT 能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂有關(guān)[10]。 另一方面，6-BA與NAA 配合使用會(huì)顯著提高叢生芽的誘導(dǎo)率[11]， 本試驗(yàn)篩選出云南甜龍竹叢生芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS + 6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.7 mg/L， 誘導(dǎo)率可達(dá)86.33%。 而以云南甜龍竹新萌發(fā)嫩枝為外植體[7]， 篩選出的叢生芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為3/4MS +6-BA 2.0 mg/L + KT 1.0 mg/L， 但誘導(dǎo)率僅為72.7%。 這種差異可能是由于外植體以及外源激素的不同而引起的。

在云南甜龍竹叢生芽增殖過程中， 6-BA 對(duì)叢生芽增殖倍數(shù)的影響最大， 這與對(duì)慈竹、 小佛肚竹(Bambusa ventricosa) 的研究結(jié)果相似[11-12]。 其次NAA 也具有較好的效果， 這與慈竹的結(jié)果相似[11]；但NAA 對(duì)小佛肚竹叢生芽的增殖并沒有顯著影響[12]， 這可能是由于竹種差異以及外植體的內(nèi)源激素含量存在差異， 從而造成其對(duì)外源激素的敏感程度不同。 本文篩選出的云南甜龍竹叢生芽最佳增殖培養(yǎng)基為MS + NAA 0.3 mg/L + 6-BA 6.0 mg/L +TDZ 0.001 mg/L， 增殖倍數(shù)可達(dá)4.90， 高于以新萌發(fā)的嫩枝為外植體的叢生芽增殖倍數(shù) (最高4.50)[7]， 這可能是由于種子萌發(fā)的叢生芽生命活力較強(qiáng)所致。

叢生芽的生根培養(yǎng)是植物快繁的關(guān)鍵技術(shù)之一[13]。 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NAA、 IBA 對(duì)云南甜龍竹生根率有顯著性影響， 最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS + NAA 2.0 mg/L + IBA 4.0 mg/L， 生根率達(dá)到71.45%。 而同樣采用NAA、 IBA、 培養(yǎng)基組合的生根培養(yǎng)基， 在其它竹種中卻取得了較高的生根率， 如麻竹(Dendrocalamus latiflorus) 在1/3MS + NAA 3 mg/L +IBA 4.5 mg/L 中， 生根率可達(dá)90%以上[14]； 以云南甜龍竹新萌發(fā)的嫩枝為外植體誘導(dǎo)的叢生芽在1/2MS +NAA 3.0 mg/L + IBA 5.0 mg/L 中， 生根率約為75%～80%[7]。 造成本試驗(yàn)中云南甜龍竹生根率較低的原因可能由于竹種和外植體差異引起的[4，15-16]。 另外， 盡管種子是竹子組培研究中難得的外植體材料，但零星開花結(jié)實(shí)的竹子種子普遍存在自交衰退的現(xiàn)象， 部分種子表現(xiàn)出萌發(fā)率低、 生活力差[17-18]， 這也可能會(huì)導(dǎo)致種胚產(chǎn)生的快繁幼苗生根困難。

本研究通過1 年多的大量重復(fù)試驗(yàn)對(duì)云南甜龍竹種胚組織培養(yǎng)進(jìn)行了詳細(xì)研究， 獲得了高增殖系數(shù)且長(zhǎng)勢(shì)較好的無(wú)菌苗； 不僅擴(kuò)展了該重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值竹種的育苗方法， 而且也為今后建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。