諶晶晶 王龍 吳立榮 李偉 周緯

心肌梗死后梗死周邊區(qū)電活動存在不均一性，易誘發(fā)折返，使惡性心律失常的發(fā)生率升高[1]。大量文獻報道，GLP-1R激動劑不僅可以降低糖尿病患者的血糖，而且能明顯降低其發(fā)生心血管事件的風險[2-4]，因此，它對心血管系統(tǒng)的作用得到了廣泛關注。然而，現(xiàn)有研究大多集中在GLP-1R激動劑對于缺血再灌注損傷及心室結構重構的影響[5-6]。既往研究結果提示，GLP-1R激動劑在心肌梗死及心肌肥厚的模型中可發(fā)揮纖維化抑制作用[7]，而心肌纖維化與心肌傳導密切相關，但對于GLP-1R激動劑在心肌梗死后能否改善心肌傳導，目前尚未見研究。本研究選用結扎大鼠前降支建立心肌梗死模型，通過GLP-1R激動劑艾塞那肽和GLP-1R拮抗劑exendin9-39，明確GLP-1R對心肌梗死周邊區(qū)電傳導的作用及其可能機制。

1 資料和方法

1.1 實驗動物

選擇喂養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學動物房的80只SPF級雄性大鼠(體質量200～250 g)。按照隨機數(shù)表分為如下4組：假手術組、心梗組、心梗+Ex-4組、心梗+Ex-4+Ex9-39組，每組20只。手術1 d后，假手術組及心梗組腹腔注射等體積生理鹽水腹腔注射；心梗+Ex-4組腹腔注射艾塞那肽2.5 μg/kg，每12 h一次；心梗+Ex-4+Ex9-39組腹腔注射exendin9-39 50 μg/kg，每12 h一次，exendin9-39注射半小時后腹腔注射2.5 μg/kg艾塞那肽。造模28 d后，開始相關檢測。

1.2 心肌梗死模型的制作

戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉；待麻醉成功后，頸部及左側前胸備皮，碘附消毒后，經頸前正中切開皮膚；逐層分離肌肉、顯露氣管，使用靜脈留置針行氣管插管，連接小動物呼吸機。大鼠右側臥位，從第三肋間切開皮膚，逐層分離肌肉、顯露心臟。以左心耳與肺動脈圓錐下緣2 mm為進針點，結扎后結扎線以下變白，心電圖提示Ⅱ導聯(lián)ST段抬高即表明造模成功。逐層關胸，胸腔負壓抽氣。假手術組只穿線，不結扎。

1.3 Langerdorff離體灌流及微電極陣列記錄

造模28 d后，腹腔注射肝素(1200 U/kg)對大鼠進行全身肝素化，并腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，開胸取出心臟；經主動脈逆行插管后，將心臟迅速懸掛于Langerdorff裝置上，并開始灌注經O2飽和、保持37℃恒溫、HEPES緩沖的Tyrode’s液，灌注壓維持在70～90 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)。Tyrode’s液的組成成分如下：NaCl 135 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L、MgCl21 mmol/L、Na2HPO40.3 mmol/L、HEPES 10 mmol/L和葡萄糖10 mmol/L，調整pH為7.3。灌流20 min后再開始記錄，對灌流過程中心肌明顯發(fā)白及發(fā)生自發(fā)性快速性心律失常的心臟予以丟棄。

1.4 微電極陣列記錄

應用德國MEA256生理記錄儀(MutiChannel公司)記錄。微電極陣列是由32個電極組成的尺寸為3 mm×3 mm的電極片，相鄰電極間隔500 μm。電極記錄的電信號經過放大器放大后，分別由Cardio 2D和Cardio 2D +軟件(德國MutiChannel公司)記錄和分析。待心臟電活動穩(wěn)定后，將電極片貼于左室梗死周邊區(qū)(假手術組貼于相同位置)記錄?？偧訒r間定義為微電極陣列的電極內，第一個被激動的微電極傳導到最后一個被激動的微電極的時間。總激動時間離散度定義為在記錄的60 s內總激動時間的離散度。傳導速度(conduction velocity，CV)定義為在微電極陣列記錄的區(qū)域內的傳導速度。

1.5 HE染色和Masson染色

造模28 d后，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)對大鼠進行麻醉；之后快速剪開胸廓，取出心臟置于10%的KCl溶液中；用生理鹽水洗盡殘血后，置于4%的多聚甲醛溶液中固定。制備心肌組織蠟塊、切片后，行HE染色和Masson染色。

1.6 Western blotting檢測縫隙連接蛋白Cx43

造模28 d后，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)對大鼠進行麻醉，快速取出心臟，分離出左室梗死周邊區(qū)，置于-80℃冰箱中保存。采用BCA法定量提取組織蛋白，各樣品取40 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳；隨后轉膜至PVDF膜上，一抗孵育24 h，二抗孵育2 h，電化學發(fā)光顯影。使用蛋白質免疫印跡法(Western blotting)檢測Cx43的表達，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參，采用維凝膠分析軟件Quantitive One 4.0(美國伯樂公司)分析膠片灰度值。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 艾塞那肽降低心肌梗死后心梗面積

對心肌組織切片進行Masson染色后，觀察各組的梗死面積。與心梗組相比，心梗+Ex-4組應用艾塞那肽后，梗死面積明顯減??；由于exendin9-39拮抗了艾塞那肽對心肌肥厚的抑制作用，心梗+Ex-4+Ex9-39組表現(xiàn)為心梗面積增大(P<0.05)(圖1A、1D)。

2.2 艾塞那肽改善心肌梗死后心肌肥厚

心梗組大鼠在造模4周后，與假手術組相比，心肌細胞橫切面積(cross-sectional area，CSA)明顯增大(P<0.05)。心梗+Ex-4組中心肌細胞CSA明顯減小(P<0.05)。與心梗+Ex-4組相比，心梗+Ex-4+Ex9-39組心肌細胞CSA增大(P<0.05)。見圖1B、1E。

2.3 艾塞那肽對心肌梗死后心臟纖維化的影響

對心肌組織切片行Masson染色，心肌梗死4周后，可觀察到梗死周邊區(qū)心肌間膠原纖維明顯增多。與假手術組相比，心梗組間質纖維化百分比明顯升高(P<0.05)。艾塞那肽干預后，心梗+Ex-4組的間質纖維化百分比顯著低于心梗組(P<0.05)。與心梗+Ex-4組相比，心梗+Ex-4+Ex9-39組間質纖維化百分比升高(P<0.05)。見圖1C、1F。

A：各組梗死面積的代表性圖片(Masson染色)；B：各組HE染色心肌橫軸切面的代表圖片(已放大400倍)；C：各組Masson染色心肌橫軸切面的代表性圖片(已放大100倍)；D：各組心梗面積的統(tǒng)計分析圖；E：各組心肌細胞橫切面積的統(tǒng)計分析圖；F：各組間質纖維化百分比的統(tǒng)計分析圖。每組大鼠6只，★：P<0.05，與假手術組比較；#：P<0.05，與心梗組比較；§：P<0.05，與心梗+Ex-4組比較

圖1 各組大鼠心梗面積、心肌細胞橫切面積及間質纖維化百分比的比較

圖.1Comparison of infarcted area, cardiomyocyte cross-sectional areaand interstitial fibrosis percentage among the four groups

2.4 艾塞那肽對大鼠梗死周邊區(qū)電傳導的影響

與假手術組相比，心梗組大鼠梗死周邊區(qū)傳導的不均一性增強，傳導速度減慢、總激動時間延長、總激動時間離散度增大(P<0.05)。與心梗組相比，心梗+Ex-4組梗死周邊區(qū)傳導均一性增強、總激動時間縮短、總激動時間離散度顯著減小(P<0.05)。與心梗+Ex-4組相比，心梗+Ex-4+Ex9-39組梗死周邊區(qū)傳導均一性降低、總激動時間延長、總激動時間離散度顯著增大(P<0.05)。見圖2。

A：各組微電極陣列記錄的代表圖；B：各組總激動時間散點圖；C：關于傳導速度的統(tǒng)計分析；D：關于總激動時間的統(tǒng)計分析；E：關于總激動時間離散度的統(tǒng)計分析。每組大鼠9只，★：P<0.05，與假手術組比較；#：P<0.05，與心梗組比較；§：P<0.05，與心梗+Ex-4組比較

圖2 各組大鼠梗死周邊區(qū)傳導速度、總激動時間及其離散度的比較

圖. 2Comparison of conduction velocity, total activation time and its dispersion in peri-infarct areas among the four groups

2.5 艾塞那肽對縫隙連接蛋白Cx43表達的影響

與假手術組相比，心梗組大鼠梗死周邊區(qū)Cx43表達明顯減弱(P<0.05)。與心梗組相比，心梗+Ex-4組Cx43的表達明顯上調(P<0.05)。與心梗+Ex-4組相比，心梗+Ex-4+Ex9-39組Cx43表達明顯減弱(P<0.05)。見圖3。

3 討論

心肌梗死后梗死周邊區(qū)電傳導的不均一性增強，傳導速度減慢，易形成折返，且與心肌梗死后心律失常的發(fā)生密切相關。GLP-1R不僅存在于胰腺，而且在GLP-1發(fā)揮作用的靶器官，如肝臟、胃腸道、骨骼肌、心臟、血管、中樞神經系統(tǒng)等都有分布[8]。既往研究主要集中在GLP-1R激動劑對于心臟結構重構的影響，本研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1R激動劑艾塞那肽可改善梗死周邊區(qū)的纖維化，增強縫隙連接蛋白Cx43的表達，可能是其改善梗死周邊區(qū)傳導的機制之一。

心肌梗死后傳導的各向異質性是電重構的主要特征之一。發(fā)生心衰時，縫隙連接蛋白表達減弱、分布紊亂，導致細胞的正常傳導順序被打亂[9]。大量的證據證實，縫隙連接蛋白的重構是心律失?；|的重要構成要件[10]。對心臟移植患者的研究發(fā)現(xiàn)，梗死周邊區(qū)Cx43重新分布且分布散亂，而不是呈簇狀分布于細胞連接處[11]。此外，Cx43的重新分布常伴有心肌傳導速度的減慢[12]。鈉電流也是心肌傳導速度的重要決定因素之一。當心衰發(fā)作時，INa的減小與INa，L的增大不僅使傳導速度減慢，而且使動作電位時程(action potential duration，APD)延長[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心肌間質纖維化程度加深，傳導速度減慢而不均一性增強。心肌纖維化阻隔了電傳導，使傳導路徑迂曲、傳導速度減慢[14-15]。對心梗后患者予以艾塞那肽治療可改善間質纖維化，原因可能與電傳導速度加快、均一性增強相關[16]。

A：各組梗死周邊區(qū)Cx43的表達條帶；B：Cx43蛋白的統(tǒng)計分析圖。每組大鼠9只，★：P<0.05，與假手術組比較；#：P<0.05，與心梗組比較；§：P<0.05，與心梗+Ex-4組比較

圖3 各組大鼠梗死周邊區(qū)Cx43的表達

圖.3Comparison of Cx43 expression in peri-infarctareas among the four groups

艾塞那肽使心梗面積縮小，可能與緩解左室壁張力[17]、激活多個促存活的蛋白激酶及改善心肌能量供應相關[18]。同時，心梗組心室腔擴張，且梗死區(qū)變薄、非梗死區(qū)肥厚；艾塞那肽治療可緩解上述改變，GLP-1R拮抗劑部分抵消了艾塞那肽對心肌細胞損傷的保護作用。在心肌重構中，心梗面積減小最終可能改善心肌纖維化及非梗死心肌的代償性肥厚，從而限制了左室的擴張。

心肌肥厚通常和間質及血管周圍纖維化同時出現(xiàn)。心臟纖維化是指Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白沉積，并與細胞外基質形成交聯(lián)。上述變化會導致室壁僵硬，并損害心臟舒張功能[19]；持續(xù)的心臟舒張功能障礙，會使壓力負荷增大，最終影響心臟收縮功能[20]。Li等[7]研究提示，GLP-1R激動劑可以通過激活AMPKα、抑制PI3K/Akt1信號通路，對心肌纖維化起到抑制作用。艾塞那肽還可能通過對心肌梗死后炎癥的調節(jié)作用來改善心肌纖維化[21]。本研究通過Masson染色來觀察和評價心肌間質纖維化的百分比，發(fā)現(xiàn)心梗組大鼠心肌間質纖維化程度加深；給予艾塞那肽治療后，該指標降低，這可能也是艾塞那肽改善梗死周邊區(qū)傳導的機制之一。

綜上所述，GLP-1R激動劑艾塞那肽可以改善心肌梗死后梗死周邊區(qū)的電傳導，其可能是通過改善心肌纖維化及增強縫隙連接蛋白Cx43的表達而發(fā)揮作用的。當然，本研究存在一定的局限性，GLP-1R激動劑艾塞那肽是與心梗組相比能明顯減小大鼠心梗面積，臨床上對于急性心肌梗死推薦早期使用再灌注治療，此時艾塞那肽能否發(fā)揮改善心肌傳導的作用尚不得而知，有待進一步研究。