李 潔，劉如秀

（中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053）

冠心病是重大心血管疾病，具有發(fā)病率高、致死率高的特點[1]。文獻表明，該病發(fā)生機制主要是氧自由基、鈣超載、能量代謝紊亂、炎癥反應(yīng)浸潤、細胞凋亡，而其中能量代謝紊亂礙是當前研究熱點，被認為是缺血/再灌注損傷的初始環(huán)節(jié)。最新研究表明，中藥可提高心肌細胞線粒體呼吸酶復(fù)合物活性、心肌線粒體跨膜電位（MMP）、心肌Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，改善缺血心肌能量代謝。因此，通過中藥調(diào)控心肌能量代謝防治缺血性心臟病具有重要的研究意義和應(yīng)用價值。

銀盞心脈滴丸是以燈盞細辛、銀杏葉、丹參、天然冰片等中藥制成的，具有活血化瘀，通脈止痛作用。文獻表明，本藥能增加冠脈血流量，降低心肌氧耗，有效抑制心電圖S-T段抬高，防治心肌缺血再灌注損[2-3]。目前，該藥已被廣泛用于治療冠心病、心絞痛等的治療[4-5]，但由于其有效成分較復(fù)雜，對分子水平研究仍不夠深入。因此本實驗采用缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2細胞損傷模型，從改善線粒體功能及減少細胞凋亡2個方面探究銀盞心脈滴丸對H9c2細胞的作用及相關(guān)機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 銀盞心脈滴丸（批號20170602），由貴州神奇藥業(yè)提供；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青、鏈霉素，購于北京索萊寶公司；胎牛血清（FBS），購于美國Gibco公司；XF細胞線粒體耗氧量檢測試劑盒，購于美國Seahorse bioscience公司；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒，購于羅氏公司。

1.2 細胞 H9C2大鼠胚胎心肌細胞系，購于中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心（Cell Resource Center，IBMS，CAMS/PUMC）。

1.3 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱，Thermo公司；光學倒置顯微鏡Olympus IX70，奧林巴斯日本；XF96海馬生物能量測定儀、XF 96細胞培養(yǎng)板和探針敏感器，美國Seahorse Bioscience公司；流式細胞儀，BD公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) H9c2細胞用含10%胎牛血清、青霉素100 kU/L、鏈霉素100 mg/L，DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，待80%～90%融合時，棄去舊培養(yǎng)基，PBS清洗，0.25%胰酶消化。在顯微鏡下觀察細胞開始變圓時加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，1380 r/min離心5 min。棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸備用。

2.2 分組及模型制備 將細胞分為對照組、模型組（缺氧/復(fù)氧）、銀盞心脈滴丸含藥血清組（30 min、12 h和24 h）。待細胞貼壁后，用預(yù)先N2飽和的缺氧培養(yǎng)基置換舊培養(yǎng)基，于密閉盒中持續(xù)通以30倍體積約1 L的95%N2-5%CO2混合氣體，充分排盡密閉盒中殘余的氧氣，后用止血鉗鉗閉進出管道，造成缺氧條件，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，；再取出換成高糖培養(yǎng)基，開放通氣管道，以恢復(fù)氧和糖供應(yīng)培養(yǎng)3 h，制備細胞損傷模型。

2.3 含藥血清的制備 參照文獻，10只大鼠，購自于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。銀盞心脈滴丸組大鼠按393.75 mg/kg（相當于臨床用量5倍）的劑量灌胃給藥。灌胃體積按1 0m L/kg計算。各組灌胃給藥每日2次。連續(xù)給藥7 d，腹主動脈取血，離心，制備血清，－80℃保存。

2.4 Seahorse能量測定儀檢測H9c2細胞線粒體能量代謝 將H9c2細胞以5 000～40 000個細胞/孔，共80μL/孔。種細胞于細胞板中，保證背景孔無細胞（A1，A12，H1，H12），接種 80 μL 培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中過夜。取XF96探針板，每孔加入200μL標準液，放好上板，保證探針浸沒在標準液內(nèi)，在無CO2的37℃培養(yǎng)箱中使探針水化24 h。用XF檢測培養(yǎng)基清洗細胞2遍，最終保留175μL。終放入37℃incubator孵育1 h。

檢測前，將試劑盒中的 oligomycin、FCCP、Rotenome/AntimycinA（R/A）配制母液。將終濃度為1 μmol/L oligomycin、1μmol/L FCCP，0.5 μmol/L R/A加載到探針板的加藥槽內(nèi)。將探針板放入機器中約20 min。平衡結(jié)束后，將底板換為種有細胞的培養(yǎng)板，根據(jù)前期設(shè)置好的程序分不同時段加入對應(yīng)的抑制劑進行上機檢測。

2.6 流式細胞儀檢測H9c2細胞凋亡 將H9c2細胞以1×106個/mL的密度種于培養(yǎng)皿中，給藥及造模情況同“2.2”項下。用PBS緩沖液清洗后加入胰酶消化，DMEM完全培養(yǎng)基終止消化并輕柔吹打促進細胞消化脫壁。將所得消化液與回收的培養(yǎng)液合并于離心管中，1 500 r/min離心5 min收集細胞。每管加入Binding Buffer 500μL重懸細胞，輕輕吹勻。最后加入Annexin V-FITC和PI溶液各5μL混勻，50度加熱5min，室溫避光染色15 min。用流式細胞儀檢測H9c2細胞凋亡。

2.7 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS22.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，采用單因素方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 不同作用時間的銀盞心脈滴丸對心肌細胞線粒體呼吸曲線的影響 本實驗選取銀盞心脈滴丸按照不同時間處理細胞，分別誘導(dǎo)細胞0.5、12和24 h進行檢測，在A、B、C藥孔中分別加入寡霉素、解偶聯(lián)劑FCCP、魚藤酮和抗霉素A（n=4）。據(jù)圖可得，當加入寡霉素后，ATP的生成會被阻斷，I/R模型組較正常組呼吸曲線下移，銀盞心脈組呼吸曲線上升。當加入FCCP后，可使線粒體呼吸達到最大值，I/R模型組較正常組呼吸曲線下移，銀盞心脈組呼吸曲線上升。而當加入魚藤酮和抗霉素A后，線粒體不能維持呼吸功能的正常進行，抑制氧化磷酸化過程。（見圖1）

圖1 不同作用時間的銀盞心脈滴丸對心肌細胞線粒體呼吸曲線的影響

3.2 不同作用時間的銀盞心脈滴丸對心肌細胞線粒體基礎(chǔ)呼吸和ATP生成量的影響 結(jié)果顯示，與正常組對比，I/R模型組使基礎(chǔ)呼吸降低[I/R：（78.3±2.5）vs.Ctrl：（110.6±1.8），n=4，P＜0.05]，加入不同作用時間的YZXM均會刺激心肌細胞增加基礎(chǔ)呼吸，[I/R：（78.3±2.5）vs.YZXM+30 min：（98.6 ±2.75）；YZXM+12 h：（85.6±1.3）；YZXM+24 h：（99.3±2.65），n=5，P<0.01]，見圖 2。

與正常組對比，模型組心肌細胞線粒體ATP生成量明顯降低[Ctrl：（65.67±2.87）vs.I/R：（49.17±2.96）]，加入不同作用時間的YZXM可增加心肌細胞線粒體 ATP 含量[YZXM+30 min：（58.45±2.8）；YZXM+12 h：（54.3±1.5）；YZXM+24 h：（57.53±2.34），n=4，P＜0.05]，見圖3。

圖2 不同作用時間的銀盞心脈滴丸對心肌細胞線粒體基礎(chǔ)呼吸的影響

圖3 不同作用時間的銀盞心脈滴丸對心肌細胞線粒體ATP生成量的影響

3.3 不同作用時間的銀盞心脈滴丸對心肌細胞線粒體呼吸儲備能力的影響 結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型組線粒體呼吸儲備能力降低（P＜0.05）。給予銀盞心脈滴丸30 min，24 h后，可以顯著上升線粒體呼吸儲備能力（P＜0.01），給予銀盞心脈滴丸12 h，線粒體呼吸儲備能力下調(diào)，究其原因，與適宜濃度相關(guān)，見圖4。

圖4 不同作用時間的銀盞心脈滴丸對心肌細胞線粒體呼吸儲備能力的影響

3.4 不同作用時間的銀盞心脈滴丸對心肌細胞線粒體最大呼吸的影響 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組線粒體最大呼吸顯著下降，銀盞心脈滴丸處理初期，最大呼吸變化顯著，12 h后最大呼吸降低明顯，至 24 h時，最大呼吸上升（n=4，P<0.05），見圖5。

3.5 不同作用時間的銀盞心脈滴丸對心肌細胞凋亡的影響 與對照組相比，模型組細胞凋亡指數(shù)均明顯高于對照組（I/R：55.8±0.56 vs.Ctrl：11.3±0.76，n=3，P<0.01）。與模型組相比，銀盞心脈滴丸作用于心肌細胞凋亡細胞百分率降低（YZXM+30min：11.8±0.69；YZXM+12h：16.1±0.94；YZXM+24h：16.1±0.71，n=3，P<0.01），以上結(jié)果提示銀盞心脈滴丸可減少缺氧/復(fù)氧心肌細胞凋亡比例，見圖6。

圖5 不同作用時間的銀盞心脈滴丸對心肌細胞線粒體最大呼吸的影響

圖6 不同作用時間的銀盞心脈滴丸對心肌細胞凋亡的影響

4 討論

心肌缺血的主要特征表現(xiàn)為嚴重缺氧、酸中毒、能量消耗和離子平衡的改變，進而導(dǎo)致心臟功能發(fā)生障礙，最終誘導(dǎo)細胞發(fā)生死亡。研究表明，在心肌細胞中，線粒體很豐富，以氧為主要底物，因此線粒體在缺血/缺氧/復(fù)氧中的作用尤為重要[6]。諸多研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙是引起心肌缺血損傷和誘導(dǎo)缺血心肌細胞調(diào)亡的重要病理機制之一，包括線粒體ATP生成減少、Ca2+超載、活性氧（ROS）生成、線粒體片段化及mPTP的持續(xù)開放等[7]。因此，研究線粒體對心肌缺血損傷的分子機制，對改善冠心病患者的臨床及預(yù)后具有重要意義。

線粒體功能與呼吸鏈結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。線粒體呼吸鏈位于線粒體內(nèi)膜上，由NADH-Q氧化還原酶、琥珀酸-Q氧化還原酶、UQ-細胞色素C氧化還原酶，細胞色素C氧化酶，ATPase（ATP合成酶復(fù)合物V）組成[8]。Seahorse能量測定儀可檢測細胞線粒體的能量代謝，實時動態(tài)監(jiān)測培養(yǎng)環(huán)境中氧分子濃度，從而反映線粒體耗氧情況。寡霉素可抑制線粒體ATP的合成，從而得出線粒體合成ATP相關(guān)的耗氧率。FCCP為解偶聯(lián)劑，加入FCCP后線粒體不生成ATP但電子傳遞持續(xù)進行，電子傳遞鏈處于最大激活狀態(tài)，使OCR達到最大?？姑顾睾汪~藤酮同時加入可完全抑制線粒體氧化磷酸過程。儲備能力的大小與細胞應(yīng)激狀態(tài)下自身的調(diào)節(jié)適應(yīng)能力相關(guān)，儲備能力的損傷或喪失將最終導(dǎo)致細胞死亡[8]。本研究運用生物能量檢測儀檢測結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧的心肌細胞其線粒體基礎(chǔ)呼吸、ATP生成、最大呼吸能力提高，呼吸儲備能力均下降。

銀盞心脈滴丸主要由燈盞細辛、銀杏葉、丹參及天然冰片組成。燈盞細辛，性味甘溫，具有解表散寒，活血化瘀，止痛消瘀功能?，F(xiàn)代藥理研究表明燈盞細辛具有抗炎、抗血小板聚集[9-10]、抑制血栓形成、防治心肌缺血[11]，改善血液流變學[12]等作用；銀杏葉，甘、苦、澀，平。歸心、肺經(jīng)。具有斂肺，平喘，活血化瘀，止痛作用。研究表明可改善缺血心肌[13]，降低心律失常的發(fā)生率[14]，擴張冠脈，清除自由基[15]、抗脂質(zhì)過氧化、抗血小板活化因子[16]、抑制血小板聚集、降血脂等作用；丹參，苦，微寒。歸心、肝經(jīng)。具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩的作用。《本草綱目》記載活血，通心包絡(luò)。治疝痛。藥理研究表明該藥可強心，增強心肌收縮力、改善心功能，降低心肌耗氧量[17]，改善微循環(huán)狀態(tài)、減輕動脈粥樣硬化、增加冠狀動脈流量。全方共奏活血化瘀，通脈止痛之功。研究表明，銀盞心脈滴丸能增加冠脈血流量，降低心肌氧耗，減少心肌缺血，有效抑制心電圖S-T段抬高，縮小試驗性心梗面積。另有研究表明，該藥能保護血管內(nèi)皮免受損傷，抑制平滑肌細胞增殖和血栓形成，從而抑制動脈粥樣硬化的形成，顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制血栓形成，對心肌缺血再灌注損傷有保護作用。本實驗研究表明銀盞心脈滴丸通過增加細胞基礎(chǔ)耗氧率及最大耗氧率，增加線粒體儲備能力，從而增強H9c2細胞抗應(yīng)激能力，改善H9c2細胞氧化損傷后線粒體能量代謝的狀態(tài)。

綜上所述，本研究基于Seahorse能量測定技術(shù)檢測線粒體能量代謝和基于流式細胞儀的細胞凋亡檢測技術(shù)，評價銀盞心脈滴丸對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細胞的保護作用。發(fā)現(xiàn)銀盞心脈滴丸可以調(diào)節(jié)線粒體能量代謝、抑制心肌細胞凋亡，從而減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷。但其分子機制仍需進一步研究。