宋 敏 ，陳 璐 ，李春曉 ，房志銳 ，張璐莎 ，Joel Wake Coffie，張麗媛 ，馬璐璐，王 虹

（1.方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617）

糖尿病足潰瘍（DFU）是糖尿病的并發(fā)癥之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率很高，近年來(lái)，世界上有近30%的人口患有糖尿病，其中650萬(wàn)人患有慢性皮膚潰瘍[1]。DFU的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中由糖尿病引起的緩慢的傷口愈合是糖尿病壞疽的主要原因[2]。在過(guò)去的幾十年中，在預(yù)防DFU患者的發(fā)病率和治療方面幾乎沒(méi)有取得突破，此外，目前用于DFU的治療藥物大多是生長(zhǎng)因子，這使得治療成本增加。因此，對(duì)于DFU的預(yù)防和治療，迫切需要更有效、更特異的藥物[3]。腦心通膠囊（NaoXinTong，NXT）是含有11種中草藥，2種樹(shù)脂藥和3種動(dòng)物藥的精粉混合物[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)的研究表明，NXT能通過(guò)抑制小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟、巨噬細(xì)胞一氧化氮吸入（iNO）和一氧化氮（NO）的生成來(lái)減少動(dòng)脈粥樣硬化[5-8]。而且腦心通能改善糖尿病小鼠的糖/脂代謝、維持組織結(jié)構(gòu)完整性、降低糖尿病引起的腎功能障礙來(lái)抑制糖尿病腎病[9]。課題組前期研究研究結(jié)果顯示NXT能促進(jìn)心肌缺血小鼠心功能恢復(fù)，減小心肌梗死面積，其機(jī)制與促進(jìn)心肌缺血邊緣區(qū)血管新生有關(guān)[10]。但NXT是否可以促進(jìn)糖尿病小鼠傷口愈合及血管新生不清楚，本研究采用db/db小鼠切除傷口夾板模型探討了NXT對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合的作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 8～12周SPF級(jí)雄性C57BL/6JNju（db/+）和 BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db/JNju（db/db）小鼠由南京大學(xué)南京生物醫(yī)學(xué)研究所提供。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方案由天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)動(dòng)物研究所（天津）于溫度22～25℃和相對(duì)濕度50%～60%條件下飼養(yǎng)。

1.2 藥物 腦心通超微粉末由陜西步長(zhǎng)制藥有限公司提供，由黃芪、赤芍、丹參、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、制乳香、制沒(méi)藥、雞血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龍、全蝎、水蛭組成。將腦心通超微粉末加入生理鹽水中配制成0.07 g/mL溶液，分裝備用。

1.3 試劑 avertin（美國(guó) Sigma公司）；RIPA（北京索萊寶科技有限公司）；蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑和 PMSF（瑞典巴塞爾羅氏集團(tuán)）；β-actin、PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT（美國(guó) Cell Signaling Technology有限公司）；其他抗體，包括VEGF，eNOS/p-eNOS（上海Abcam有限公司）；血糖儀和血糖試紙（瑞典巴塞爾羅氏集團(tuán)）；甲醇等其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

2 方法

2.1 造模 小鼠腹腔注射Avertin（16.5 mL/kg），在麻醉下從背部表面去除毛發(fā)后，在小鼠中線上創(chuàng)建一個(gè)6 mm的全層切除皮膚傷口。用粘合劑硅膠板固定在傷口周?chē)?，并?-0縫合線縫合。在傷口上滴下慶大霉素后，用無(wú)菌透明敷料覆蓋傷口，每2日更換1次。

2.2 分組及給藥 將db/db和db/+小鼠按體重隨機(jī)分為 3組：db/+Saline組、db/db Saline組、db/db NXT組[腦心通0.7 g/（kg·d）]。給藥組給予相應(yīng)的腦心通藥液，模型組給予等量的生理鹽水，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥17 d。

2.3 傷口愈合分析 用照相機(jī)對(duì)傷口閉合區(qū)進(jìn)行追蹤，每2天追蹤1次。用Image J軟件對(duì)創(chuàng)面閉合度進(jìn)行量化，以創(chuàng)面愈合面積百分比表示，計(jì)算為：[1-（day X創(chuàng)面面積/day 0天創(chuàng)面面積）]×100%。

2.4 HE染色 創(chuàng)面皮膚組織用4%聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（5μm）。石蠟切片加熱60℃過(guò)夜，然后通過(guò)二甲苯和一系列分級(jí)乙醇溶液脫蠟。然后進(jìn)行蘇木精染色，鹽酸分化，流水沖洗后酒精脫水，伊紅溶液染色。最后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。HE染色后，體式顯微鏡拍片，用Image J計(jì)算肉芽組織面積和上皮化程度。

2.5 免疫熒光評(píng)價(jià) 小鼠在處死前30 min靜脈注射50μL的Griffonia Simpli-cifolia Lectin I（1mLHKS緩沖液稀釋?zhuān)?。?chuàng)面皮膚組織用4%聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（5μm）。石蠟切片加熱60℃過(guò)夜，然后通過(guò)二甲苯和一系列分級(jí)乙醇溶液脫蠟。切片用預(yù)熱抗原修復(fù)液孵育10 min，在PBS中洗滌3次后，用5%胎牛血清在PBS中室溫下封閉1 h。將一抗ANTI-SOYBEANAGGLUTININ（PBS緩沖液稀釋1∶100）與切片在4℃下隔夜孵育，二抗DyLight?594 ANTI-GOATIgG（H+L）（PBS 緩沖液稀釋 1∶200）在室溫黑暗環(huán)境中孵育20 min。用抗熒光衰退淬滅劑封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

2.6 Western blotting 將組織放入預(yù)冷的裂解液中（10 mL裂解液：10 mL RIPA+0.1 g蛋白酶抑制劑+0.1 g磷酸酶抑制劑+50μL PMSF），研磨破碎，4℃離心，12 000 r/min共15 min，吸取上層上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，定量。在10%SDS-PAGE上分離每個(gè)樣品，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在TBST中用5%牛血清白蛋白或脫脂牛奶（TBS中用0.1%Tween-20）封閉3 h后，在4℃下與各自的一抗孵育過(guò)夜，后用TBST徹底洗滌。然后，將膜與二抗辣根過(guò)氧化物酶（1∶10 000）在室溫下孵育1 h。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑進(jìn)行印跡檢測(cè)。用Image J量化蛋白條帶的灰度強(qiáng)度，并與每個(gè)樣品中的β-actin進(jìn)行歸一化。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS軟件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 腦心通膠囊對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合的影響 術(shù)后給藥16 d后，與正常小鼠的傷口愈合相比，糖尿病模型組小鼠在組織損傷后的傷口愈合速率明顯降低（P＜0.05或 P＜0.01），在糖尿病小鼠中，腦心通組與模型組相比較，損傷后10～14 d傷口愈合率腦心通組明顯高于模型組（P＜0.05），說(shuō)明腦心通能明顯促進(jìn)糖尿病小鼠的傷口愈合速率，見(jiàn)圖1。

3.2 腦心通膠囊對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠傷口邊緣肉芽組織的形成和上皮化的影響 術(shù)后7，16 d，HE免疫組化染色，觀察傷口邊緣組織形態(tài)。如圖2所示：在術(shù)后7 d，3組小鼠都處于傷口愈合期，傷口邊緣組織中能觀察到明顯的肉芽組織和上皮化，與db/+Saline小鼠相比，db/db Saline小鼠傷口組織邊緣肉芽組織面積和上皮化程度明顯降低，而與db/db Saline相比，db/db NXT組小鼠傷口邊緣上皮化明顯增加，肉芽組織的面積無(wú)明顯變化。術(shù)后16 d，db/+Saline小鼠傷口完全愈合，傷口組織邊緣肉芽組織和上皮化退化，角質(zhì)層形成，與db/+Saline小鼠相比，db/db Saline小鼠傷口組織邊緣肉芽組織和上皮化明顯，而在db/db小鼠中，傷口仍處于愈合階段，傷口組織邊緣能觀察到明顯的肉芽組織和上皮化，但與db/db Saline相比，db/db NXT組小鼠傷口邊緣肉芽組織的面積增加和上皮化降低。

3.3 腦心通對(duì)糖尿病小鼠的體質(zhì)量、空腹血糖的影響 如圖3所示，與db/+相比較，db/db小鼠的體質(zhì)量和血糖均高于db/+小鼠，而腦心通給藥組與db/db模型組相比，體質(zhì)量和血糖均沒(méi)有明顯變化。

3.4 腦心通對(duì)傷口邊緣血管密度和VEGF的表達(dá)的影響 如圖4～6所示，與正常的小鼠相比，db/db Saline組傷口周?chē)难苊芏群兔?xì)血管密度明顯降低（P＜0.01），而 db/db NXT組與 db/db Saline組相比，傷口周?chē)难苊芏群兔?xì)血管密度也明顯增加（P＜0.05），Western blotting的結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比，在組織損傷7 d時(shí)，db/db Saline組VEGF表達(dá)量明顯降低，而db/db NXT組與db/db Saline組相比，VEGF的表達(dá)量明顯增加。

3.5 腦心通對(duì)PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路的影響在圖7中，與正常小鼠相比，db/db Saline組的PI3K磷酸化明顯降低（P＜0.05），而db/db NXT組與db/db Saline相比PI3K、AKT和eNOS磷酸化明顯增加（#P＜0.05 and##P＜0.01），說(shuō)明腦心通能促進(jìn) PI3K、AKT和eNOS的磷酸化，從而激活PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路。

圖1 腦心通對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合的影響

圖2 腦心通對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠傷口處肉芽組織形成和上皮化的影響

圖3 腦心通Ⅱ型糖尿病小鼠體質(zhì)量、空腹血糖的影響

4 討論

圖4 腦心通對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠傷口邊緣血管密度的影響（n＝6）

圖5 腦心通對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠傷口邊緣毛細(xì)血管的影響

圖6 腦心通對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠傷口周?chē)M織VEGF表達(dá)的影響

圖7 腦心通對(duì)PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路的影響

糖尿病傷口愈合遲緩或者不愈合是導(dǎo)致DFU的主要原因[2]。目前，臨床上用于治療糖尿病傷口愈合的方法主要有加強(qiáng)傷口護(hù)理，降低局部壓力，改善微循環(huán)和控制炎癥反應(yīng)等，但在臨床應(yīng)用中只能達(dá)到很低的愈合率。近年來(lái)干細(xì)胞技術(shù)、生長(zhǎng)因子治療、氧療等雖然應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室和臨床，但仍存在治療效果短暫和成本較高等弊端[11]。因此，對(duì)于DFU的治療，需要更有效、更特異的藥物。NXT是在經(jīng)方補(bǔ)陽(yáng)還五湯的基礎(chǔ)上加入乳香、沒(méi)藥、丹參、雞血藤增加其活血化瘀作用，臨床上主要用來(lái)治療缺血性心腦血管疾病。在本研究中，我們使用Ⅱ型糖尿病小鼠，建立切除性創(chuàng)面夾板模型，該模型將夾板緊密地貼附在創(chuàng)面周?chē)钠つw上，通過(guò)減少由于皮膚收縮和創(chuàng)面敷料引起的變化，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面均勻閉合，使傷口愈合的過(guò)程更接近于Ⅱ型糖尿病人傷口愈合的過(guò)程[12]。筆者研究結(jié)果顯示NXT可以促進(jìn)Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合，提示NXT可以用于治療糖尿病并發(fā)癥。

組織損傷時(shí)釋放出多種損傷相關(guān)分子，引發(fā)急性促炎反應(yīng)，導(dǎo)致各種促炎介質(zhì)（如細(xì)胞因子和趨化因子）的釋放，這些介質(zhì)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞募集，分泌細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，以及各種細(xì)胞，主要是成纖維纖維細(xì)胞的增殖和遷移，形成肉芽組織，最后肉芽組織變薄，細(xì)胞外基質(zhì)的聚集和沉積形成瘢痕[13-16]。在肉芽組織的形成過(guò)程中，細(xì)胞的增殖和遷移所需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需要血管的運(yùn)輸，因此血管新生在肉芽組織的形成過(guò)程中發(fā)揮了很大的作用。但是在糖尿病患者中，高糖環(huán)境和持續(xù)的炎癥反應(yīng)使內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量減少，其增殖、遷移、黏附、血管新生的能力減弱，微血管損傷，血管新生受損，傷口愈合推遲[17]。筆者以前的研究表明，NXT能減小急性心肌梗死小鼠心肌梗死面積，促進(jìn)心功能恢復(fù)，其機(jī)制與促進(jìn)缺血組織血管新生有[18]。本研究采用Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合模型進(jìn)一證實(shí)NXT可以促進(jìn)損傷組織血管新生及肉芽組織形成，加速傷口愈合。

傷口愈合中的血管新生依賴(lài)于促血管生長(zhǎng)因子的作用，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是已知最強(qiáng)的促進(jìn)血管新生因子，VEGF與其受體結(jié)合后可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，從而促進(jìn)血管新生，但是在糖尿病環(huán)境下，VEGF的表達(dá)下調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖和粘附的能力減弱，血管新生受到抑制[19-20]。PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路是激活酪氨酸激酶信號(hào)通路，當(dāng)VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體的結(jié)合能激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶，觸發(fā)多種促進(jìn)血管生成的下游信號(hào)，大量的證據(jù)表明PI3K/AKT/eNOS相關(guān)的信號(hào)通路參與內(nèi)皮細(xì)胞的存活與增殖，從而促進(jìn)血管新，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的磷酸化能刺激誘導(dǎo)下游蛋白絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）的磷酸化，磷酸化的AKT導(dǎo)致其下游一氧化氮合酶 （eNOS）底物的激活，從而促進(jìn)NO的產(chǎn)生，NO是維持內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的基本分子[10，21]。筆者結(jié)果表明腦心通能促進(jìn)PI3K、AKT和eNOS磷酸化，從而激活PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路，增加VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管新生和傷口愈合。筆者以前的研究顯示腦心通能激活VEGF/eNOS信號(hào)通路增加缺血區(qū)毛細(xì)血管密度促進(jìn)心肌缺血小鼠心功能恢復(fù)[21]。本研究結(jié)果顯示在傷口愈合的過(guò)程中腦心通能激活PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路，增加VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管新生從而促進(jìn)肉芽組織的形成，加速Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合。

綜上所述，腦心通膠囊能促進(jìn)Ⅱ型糖尿病小鼠傷口愈合，其作用機(jī)制與激活PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路、上調(diào)VEGF的表達(dá)從而促進(jìn)組織血管新生有關(guān)。本研究為NXT應(yīng)用于糖尿病并發(fā)癥的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而NXT成分復(fù)雜，其促進(jìn)Ⅱ型糖尿病傷口愈合多靶點(diǎn)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。