楊 博

（天津市北辰醫(yī)院心內(nèi)科，天津 300400）

隨著研究的不斷深入，目前認為，冠心病是由年齡、高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙及遺傳等多種因素造成的疾病。已有研究表明，許多基因多態(tài)性可能對冠心病的發(fā)生發(fā)展起促進作用。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABCA1）基因?qū)儆谌姿嵯佘战Y(jié)合盒轉(zhuǎn)運體（ABC）超家族成員之一[1-2]。ABCA1能夠?qū)毎麅?nèi)游離磷脂以及膽固醇的流出起到促進作用，參與體內(nèi)高密度脂蛋白膽固醇的形成以及膽固醇的逆轉(zhuǎn)運過程，進而對動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響[3-5]。隨著對ABCA1基因不斷深入的研究，結(jié)果顯示普通人群中ABCA1基因的多態(tài)性位點可能與冠心病的易感性相關(guān)[6]。筆者通過比較中國男性漢族人群中冠心病患者與正常對照人群之間ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點的基因型頻率，分析中國漢族人群冠心病易感性與ABCA1基因rs363717多態(tài)性間的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 研究對象包括165例滿足世界衛(wèi)生組織制定的冠心病的定義以及診斷標準的冠心病患者（冠心病組），以及165例健康人（對照組）。

冠心病組：由至少兩位經(jīng)驗豐富的醫(yī)生通過選擇性冠狀動脈造影證實，患者的左主干、前降支、回旋支以及右冠狀動脈存在一處及以上的內(nèi)徑狹窄不低于50%。

對照組：正常對照組受試者滿足無冠心病相關(guān)臨床癥狀以及冠心病史，心電圖檢查結(jié)果顯示各項指標均在正常范圍內(nèi)。

此外，冠心病組與正常對照組受試者全部是我國年齡50～70歲的男性漢族人群，兩組受試者在收縮壓、舒張壓、血總膽固醇（TC）水平、甘油三酯（TG）水平、高密度脂蛋白水平（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平、空腹血糖以及是否合并高血壓、糖尿病、吸煙及飲酒方面均相匹配（經(jīng)正規(guī)治療后），兩組受試者間不存在血緣關(guān)系，本研究選取受試者時排除惡性腫瘤患者以及嚴重肝腎功能不全者。

1.2 冠心病患者冠狀動脈病變支數(shù)的判定標準 由至少兩位經(jīng)驗豐富的醫(yī)生判定冠心病患者左主干、前降支、回旋支以及右冠狀動脈阻塞病變的程度，其狹窄大于或等于50%判定為有意義。此外，單支病變、雙支病變以及三支病變的定義標準以有意義病變累及支數(shù)為依據(jù)，左主干受到累及者計為兩支病變。

1.3 入選標準 采用問卷調(diào)查的方式統(tǒng)計兩組受試者年齡、是否合并高血壓、糖尿病、吸煙及飲酒方面的基本信息。主要相關(guān)因素與指標包括血糖、收縮壓、舒張壓、血清總膽固醇水平、甘油三酯水平、高密度脂蛋白水平以及低密度脂蛋白水平等。

入選標準如下：年齡50～70歲，男性，經(jīng)正規(guī)藥物治療后，空腹血糖 4～7 mmol/L；血壓 100～140/60～90 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；TC 小于 5 mmol/L；TG小于3 mmol/L；HDL-C大于 0.8 mmol/L；LDLC小于3.5 mmol/L。

1.4 試驗方法 按試劑盒說明從白細胞中提取基因組DNA。

1.4.1 DNA濃度以及純度的檢測步驟 DNA濃度以及純度采用分光光度計進行檢測，分別測定DNA樣品在260納米以及280納米波長下的吸光度值（即A260與A280）。DNA樣品含量通過朗伯-比爾定律進行計算，具體計算公式為：DNA樣品物質(zhì)的濃度（mol/L）=DNA樣品在260納米波長下的吸光度值/（摩爾吸光系數(shù)×DNA樣品的光程），DNA樣品的純度通過A260與A280的比值進行評估。為確保實驗數(shù)據(jù)的準確性，本研究中采用的將DNA樣品稀釋至100 ng/μL，純度保持在 1.8～1.9 之間。

1.4.2 ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點的檢測

1）聚合酶鏈式反應（PCR）引物序列：

正向引物序列：5’-ACGTTGGATGCTGAAGTCTTACACCTTTAGC-3’。

反向引物序列：5’-ACGTTGGATGGGGAAGTTCAAGTGATCTTTC-3’。

2）PCR反應在PCR熱循環(huán)以上進行，反應產(chǎn)物置于4℃冰箱保存以備使用。具體反應體系及反應條件見表1，表2。

表1 ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點檢測PCR反應體系

3）酶切反應具體反應體系見表3。

表3 ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點酶切反應體系

反應條件：將上述反應體系保持于37℃的水浴過夜后將產(chǎn)物進行經(jīng)瓊脂糖（濃度為2.5%）凝膠電泳，電壓為90 V，時間為60 min，電泳結(jié)束后采用紫外光凝膠成像系統(tǒng)鑒定受試者該多態(tài)性位點的基因型。

1.5 統(tǒng)計分析 采用問卷調(diào)查的方式統(tǒng)計兩組受試者年齡、是否患有高血壓、糖尿病、吸煙及飲酒方面的基本信息；測定兩組受試者不同多態(tài)性位點的基因型并計算相應的等位基因型頻率；兩組受試者中等位基因頻率是否滿足群體代表性通過Hardy-Weinberg平衡來檢驗。本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。采用方差分析計量數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用的統(tǒng)計學方法包括t檢驗、卡方檢驗，P<0.05表示差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點兩組受試者的基本臨床信息比較 本研究共包括ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點基因分型的受試者330例，冠心病組以及正常對照組中分別包含165例受試者，為排除冠心病主要危險因素如血壓、血脂、血糖水平、吸煙等對本研究結(jié)果的影響，入選標準做了限定，使其各方面均相匹配。通過分析顯示，兩組受試者在年齡、收縮壓、舒張壓、TC水平、TG水平、HDL-C水平、LDL-C水平、空腹血糖以及是否患有高血壓、糖尿病、吸煙及飲酒方面均不存在顯著差異（P>0.05），見表 4。

2.2 兩組受試者ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點的基因型及等位基因分布情況 Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示，在ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點的基因型頻率的分布上，冠心病組與正常對照組受試者均滿足Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），故可以推斷本研究中選取的受試者具有良好的代表性，研究數(shù)據(jù)可信度高；冠心病組受試者AA、AG以及GG 3種基因型的分布與正常對照組之間均不存在顯著差異（P>0.05）；冠心病組內(nèi)AA基因型頻率顯著高于AG以及GG基因型，且差異存在統(tǒng)計學意義（P<0.05）；冠心病組受試者ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點的A等位基因頻率（76.06%）高于正常對照組（66.67%），且差異存在統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表 5。

2.3 冠心病組中ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點各基因型中的血脂水平情況 本研究通過結(jié)合LSD法以及單因素方差分析法，比較冠心病組受試者中ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點AA基因型與（AG+GG）基因型中的血脂濃度水平，結(jié)果顯示，AA基因型與（AG+GG）基因型在 TC、TG、HDL-C以及LDL-C水平上均不存在顯著差異（P>0.05），見表 6。

2.4 ABCA1基因rs363717多態(tài)性基因型頻率與冠心病患者冠狀動脈病變程度的關(guān)聯(lián) 研究結(jié)果顯示：冠心病患者AA基因型中發(fā)生單支病變、雙支病變以及3支病變的患者分別為57例、36例及25例，（AG+GG）基因型中發(fā)生單支病變、雙支病變以及3支病變的患者分別為23例、19例及15例，兩組基因型之間不存顯著差異（P>0.05），即未發(fā)現(xiàn)血管病變支數(shù)與rs363717多態(tài)性位點的G等位基因之間的關(guān)聯(lián)性，見表7。

表4 兩組受試者的基本臨床信息比較（x±s）

表5 兩組受試基因型及等位基因分布比較

表6 AA基因型與（AG+GG）基因型中血脂水平比較（x±s）

表7 基因型頻率與冠心病患者冠狀動脈病變程度的關(guān)聯(lián)

3 討論

通過入選標準限定，本研究分析顯示，兩組受試者在年齡、收縮壓、舒張壓、TC水平、TG水平、HDL-C水平、LDL-C水平、空腹血糖以及是否合并高血壓、糖尿病、吸煙及飲酒方面均不存在顯著差異（P>0.05），且Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示，在APOA5基因1131C和c.553T多態(tài)性位點的基因型頻率的分布上，冠心病組與正常對照組受試者均滿足Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），故可以推斷本研究中選取的受試者具有良好的代表性，研究數(shù)據(jù)可信度高。

在ABCA1基因啟動子區(qū)域、3’UTR等非蛋白編碼區(qū)以及編碼氨基酸序列的編碼區(qū)均存在ABCA1基因的多態(tài)性位點[7-8]。rs363717位點處在ABCA1基因的3’UTR的非編碼區(qū)，該區(qū)域的位點突變可能導致ABCA1基因的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而對mRNA的穩(wěn)定性造成影響，此外還可能對mRNA以及其互補結(jié)合miRNA間的相互作用產(chǎn)生影響[9-11]。故而推斷rs363717位點多態(tài)性位點可能通過阻礙mRNA和miRNA互補結(jié)合過程以及增加ABCA1基因mRNA的穩(wěn)定性來激活ABCA1蛋白的表達，降低冠心病的易感性[12]。本研究ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點與冠心病的關(guān)聯(lián)性結(jié)果顯示：冠心病組受試者ABCA1基因rs363717多態(tài)性位點的A等位基因頻率（76.06%）高于正常對照組（66.67%），且差異存在統(tǒng)計學意義（P<0.05），由此可以推斷rs363717多態(tài)性位點的A等位基因可能與中國男性漢族人群冠心病的易感性相關(guān)。國外研究表明，當rs363717位點的等位基因A突變?yōu)镚時，冠心病的發(fā)病風險降低，推斷等位基因G是冠心病的保護因子[13]，進而推斷G等位基因亦可能是中國男性漢族人群冠心病的保護位點。

本研究通過對ABCA1基因rs363717多態(tài)性基因型頻率與冠心病患者冠狀動脈病變程度比較，AA基因型與（AG+GG）基因型之間不存顯著差異（P>0.05），未發(fā)現(xiàn)中國男性漢族人群中冠心病患者血管病變支數(shù)與rs363717多態(tài)性位點的G等位基因之間的關(guān)聯(lián)性。