王夏　龔韜　孫麗蘊(yùn)　李拓新　朱青　宋京美

[摘要] 目的 建立蒿秦化斑顆粒中馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的高效液相色譜（HPLC）測(cè)定方法。 方法 采用Kinetex EVO C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，柱溫35℃。 結(jié)果 馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y=1.5×103X-0.88（r = 0.9999）、Y=9.8×102X-2.95（r = 0.9999）、Y=1.4×103X-3.97（r = 0.9999）、Y=2.4×103X-0.33（r = 0.9999）;線性范圍分別為0.03～0.69 mg/L、0.15～3.00 mg/L、0.17～3.44 mg/L、0.01～0.11 mg/L，平均加樣回收率分別為97.85%、98.30%、94.66%、96.08%，RSD分別為1.00%、0.69%、1.72%、1.90%。 結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可用于蒿秦化斑顆粒中四種成分的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞] 蒿秦化斑顆粒;馬錢(qián)苷酸;龍膽苦苷;芍藥苷;5-O-甲基維斯阿米醇苷;高效液相色譜法;含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R286.0? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）06（a）-0028-05

Content determination of four components in Haoqin Huaban Granules by HPLC

WANG Xia1? ?GONG Tao1▲? ?SUN Liyun2? ?LI Tuoxin1? ?ZHU Qing1? ?SONG Jingmei1

1.Institute of Clinical Pharmacy of Beijing Municipal Health Bureau， Beijing? ?100035， China; 2.Dermatology， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affilionted to Capital Medical University， Beijing? ?100010， China

[Abstract] Objective To establish high-performance liquid chromatography （HPLC） method for the content determination of the loganic acid， gentiopicroside， paeoniflorin and 5-O-methylvisamminol in Haoqin Huaban Granules. Methods The column was Kinetex EVO C18 （150 mm × 4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution with gradient elution at the flow rate of 1.0 mL/min. The detecting wavelength was 235 nm and the column temperature was 35℃. Results The standard curve of loganic acid， gentiopicroside， paeoniflorin and 5-O-methylvisamminol were Y = 1.5×103X - 0.88 （r = 0.9999），Y = 9.8×102X - 2.95 （r = 0.9999），Y =1.4×103X - 3.97 （r = 0.9999），Y =2.4×103X - 0.33 （r = 0.9999）， and the linear ranges of loganic acid， gentiopicroside， paeoniflorin and 5-O-methylvisamminol were 0.03-0.69 mg/L， 0.15-3.00 mg/L， 0.17-3.44 mg/L， 0.01-0.11 mg/L，respectively. The average recoveries of loganic acid， gentiopicroside paeoniflorin and 5-O-methylvisamminol were 97.85%， 98.30%， 94.66%， 96.08%， the RSD were 1.00%，0.69%，1.72%，1.90%， respectively. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible. It is effective in controlling the quality of Haoqin Huaban Granules.

[Key words] Haoqin Huaban Granules; Loganic acid; Gentiopicroside; Paeoniflorin; 5-O-methylvisamminol; High-performance liquid chromatography; Content determination

中藥最重要的特點(diǎn)就是多成分、多靶點(diǎn)，中藥的多種活性成分是其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，多成分的質(zhì)控模式是中藥質(zhì)量控制研究的重點(diǎn)[1-2]。蒿秦化斑顆粒由青蒿、地黃、水牛角、秦艽、赤芍、牡丹皮、防風(fēng)、甘草8味藥材組方而成，具有清熱解毒、涼血化癍的功效，用于日曬瘡，熱毒蘊(yùn)膚證。本研究在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化改進(jìn)測(cè)定方法[3-17]，采用高效液相色譜法測(cè)定馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷4種成分的含量，方法準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，提供了更加全面有效的定量分析手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent，1100）;DAD二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent）;電子天平（METTLER TOLEDO，XP105DR）;紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)（SHIMADZU，UV2600）;超聲波清洗器（北京科璽世紀(jì)科技有限公司，KX-2127QT）。

1.2 試藥

馬錢(qián)苷酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111865-201403，純度：94.7%）;龍膽苦苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110770-201716，純度：97.6%）;芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-200630，純度100%）;5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：1523-200001，純度：93.8%）。

蒿秦化斑顆粒（每1 g含生藥3.113 g，規(guī)格：12 g/袋，批號(hào)：170424，170425，170426），屬于首都醫(yī)科大學(xué)北京中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑。乙腈（Fisher Chemical，色譜純）、磷酸為優(yōu)級(jí)純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kinetex EVO C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備

精密稱取馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含馬錢(qián)苷酸34.76 μg、含龍膽苦150.30 μg、含芍藥苷172.16 μg、含5-O-甲基維斯阿米醇苷5.50 μg混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

取蒿秦化斑顆粒，研細(xì)，精密稱定0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率180 W，頻率60 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備

按處方中藥味的比例及制法分別制備不含秦艽（馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷）、防風(fēng)（5-O-甲基維斯阿米醇苷）、赤芍和牡丹皮（芍藥苷）的陰性樣品，再按照“2.3”項(xiàng)下方法制備相應(yīng)的陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性考察

分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL注入液相色譜儀，結(jié)果表明陰性對(duì)照不干擾對(duì)應(yīng)成分的測(cè)定且其分離度均大于1.5，表明此方法的專屬性較強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及線性范圍。見(jiàn)表2。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷四種成分的峰面積，其RSD分別為0.80%、0.36%、0.53%、1.32%，提示儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0、4、8、12、16 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為0.52%、0.88%、0.86%、1.92%，提示供試品溶液在16 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果馬錢(qián)苷酸平均含量為0.1697%，RSD為0.18%;龍膽苦苷平均含量為0.6995%，RSD為0.70%;芍藥苷平均含量為0.7582%，RSD為0.49%、5-O-甲基維斯阿米醇苷平均含量為0.0226%，RSD為1.96%，提示該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的蒿秦化斑顆粒樣品9份，每份0.15 g，精密稱定，分別按已知含量的50%、100%、150% 3個(gè)水平加入對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均加樣回收率分別為97.85%、98.30%、94.66%、96.08%，RSD分別為1.00%、0.69%、1.72%、1.90%，提示該方法的準(zhǔn)確性良好。見(jiàn)表3。

2.11 含量測(cè)定

取3批蒿秦化斑顆粒樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量。見(jiàn)表4。

2.12 高效液相色譜法的耐用性考察

在耐用性考察范圍內(nèi)，色譜條件中檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相酸度、流速微小變化時(shí)，含量測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而柱溫改變對(duì)含量測(cè)定結(jié)果影響較大，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中予以關(guān)注并嚴(yán)格控制。見(jiàn)表5。

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（收稿日期：2018-12-03? 本文編輯：王? ?蕾）