高耀星　于建設(shè)　都日娜　楊麗敏　趙鵬偉　孫鵬

[摘要] 目的 探討黃連水提物對(duì)人皮膚腫瘤A431細(xì)胞凋亡、增殖的影響。 方法 采用低溫提取工藝，從藥材中提取出水溶性的小分子混合物，用紫外色譜分析儀檢測(cè)混合物成分;采用MTT法檢測(cè)藥物對(duì)人皮膚腫瘤A431細(xì)胞的抑制作用，藥物設(shè)4個(gè)濃度，即6.3、12.5、25、50 μg/μL，并將其作為藥物組，未加藥物的為對(duì)照組，觀察24、48、72 h抑瘤率;然后用Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象;通過MTT篩選后，用25 μg/μL黃連水提物作用腫瘤A431細(xì)胞48 h后，用Western blot 檢測(cè)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2凋亡途徑的影響。 結(jié)果 紫外光譜分析黃連水提物主要成分為核酸、生物堿等，MTT顯示25 μg/μL黃連水提取物在48 h對(duì)A431細(xì)胞的抑制率已達(dá)到最佳（P < 0.05）。顯微鏡下，對(duì)照組無變化。25 μg/μL黃連水提物孵育48 h后，細(xì)胞明顯的數(shù)量減少、變圓、漂浮;Tunel顯示25 μg/μL黃連水提物核定位處綠光明顯增多，提示細(xì)胞大量凋亡。本研究檢測(cè)顯示，25 μg/μL黃連水提取物孵育48 h后，腫瘤A-431細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達(dá)量顯著升高，而Bcl-2的表達(dá)量顯著降低。 結(jié)論 本研究初步表明黃連水提小分子混合物可促進(jìn)A-431細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。其機(jī)制包括細(xì)胞外凋亡通路和細(xì)胞內(nèi)凋亡通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9上調(diào)及抑制凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)。這進(jìn)一步明確了黃連水提物在治療皮膚腫瘤中的作用機(jī)制，為皮膚腫瘤的治療提供的方法。

[關(guān)鍵詞] 黃連水提物;皮膚腫瘤;A431細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;Bcl-2;Caspase-3;Caspase-8;Caspase-9

[中圖分類號(hào)] R739.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）06（a）-0021-05

Effects of water extract of berberine on apoptosis and proliferation of human skin tumor A431 cells

GAO Yaoxing1? ?YU Jianshe1? ?DU Rina2? ?YANG Limin2? ?ZHAO Pengwei3? ?SUN Peng3

1.Department of Anesthesiology， Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot? ?010010， China; 2.Department of Dermatology， International Mongolian Medical Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot? ?010010， China; 3.Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot? ?010010， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of water extract of berberine on apoptosis and proliferation of human skin tumor A431 cells. Methods The low temperature extraction process was used to extract the water-soluble small molecule mixture from the medicinal materials. MTT assay was used to detect the inhibitory effect of the drug on human skin tumor A431 cells. Four concentrations of 6.3， 12.5， 25， 50 μg/μL were set as the drug group， and those without the drug were set as the control group. The tumor inhibition rates at 24， 48 and 72 h were observed. Tunel was used to detect apoptosis. After being screened by MTT， the apoptosis pathways of caspase-3， caspase-8， caspase-9 and Bcl-2 were detected by Western blot after treating tumor A431 cells with 25 μg/μL water extract for 48 h. Results The main components were nucleic acid， alkaloid， etc. MTT showed that the inhibition rate of 25 μg/μL water extract of berberine on A431 cells reached the best at 48 h （P < 0.05）. Under the microscope， there was no change in the control group. After incubated with 25 μg/μL water extract of berberine for 48 h， the number of cells significantly decreased， became round and floated. Tunel showed 25 μg/μL water extract of berberine significantly increased green light at the approved location， indicating a large number of apoptosis. In this study， after incubated with 25 μg/μL water extract of berberine for 48 h， and the expressions of caspase-3， caspase-8 and caspase-9 in tumor A431 cells were significantly increased， while the expression of Bcl-2 was significantly decreased. Conclusion This study preliminarily showed that the small molecule mixture of water extract from rhizoma coptiliae could promote apoptosis of A431 cells and inhibit cell proliferation. The mechanisms include the extracellular apoptosis pathway and the intracellular apoptosis pathway， leading to the up-regulation of caspase-3， caspase-8 and caspase-9 in tumor cells and the down-regulation of the apoptotic protein Bcl-2. This study further clarified the mechanism of wat extract of berberine in the treatment of skin tumors and provided methods for the treatment of skin tumors.

[Key words] Water extract of berberine; Skin tumor; A431 cells; Apoptosis; Bcl-2; Caspase-3; Caspase-8; Caspase-9

皮膚鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌是皮膚科常見的惡性腫瘤之一，占皮膚惡性腫瘤的70%左右，該腫瘤好發(fā)于老年人的曝光部位[1]。病因可能與日光照曬、大劑量X線照射、接觸砷化物等有關(guān)系[2]。目前臨床多采用手術(shù)切除及放化療，輔以光動(dòng)力療法[3]治療，效果不理想。手術(shù)治療皮膚腫瘤會(huì)與面部術(shù)后恢復(fù)產(chǎn)生矛盾[4]。中草藥屬于天然產(chǎn)物，副作用較少，尋求有效的中草藥用于惡性腫瘤的治療已成為抗腫瘤治療研究的焦點(diǎn)之一。

黃連為毛茛科植物黃連的干燥根莖，味苦、性寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)。具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效[5]?，F(xiàn)代藥理研究[6-7]表明，黃連不僅具有抗菌、抗病毒的功效，還具有利膽、抗腫瘤等藥理作用，被廣泛應(yīng)用于各種病證的治療，如抑制胃癌、食道癌、肺癌等，但無在皮膚科領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，本研究采用低溫提取工藝方法，探討黃連水提物對(duì)人皮膚腫瘤A431細(xì)胞系增殖率的影響及其作用機(jī)制，為傳統(tǒng)中藥的開發(fā)提供科學(xué)數(shù)據(jù)，為皮膚腫瘤提供新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

黃連，購自安國藥物批發(fā)市場（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥教授鑒定）;A431細(xì)胞，購于ATCC細(xì)胞庫;Caspase-3（CST，9662S）、Caspase-8（CST 4790S）、Caspase-9（CST 9504S）、Bcl-2（CST 2872S）;兔抗人一抗（CST 4970S）、二抗辣根過氧化物酶羊抗兔（北京全式金生物技術(shù)有限公司HS101-01）、脫脂奶粉（BD 232100），PVDF膜（MILIPORE ISE Q00010），SDS-PAGE制膠試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0012A）、Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司FA201-01）、ELC顯色液（北京全式金生物技術(shù)有限公司DW101-01）。DMEM培養(yǎng)基（北京全式金生物技術(shù)有限公司FI101-01）、10%胎牛血清均購自Sigma公司。

1.2 儀器

紫外分光光度計(jì)U-3900（HITACHI），酶標(biāo)儀Multiskan GO（Thermo）;LEICA DM4000B LED熒光顯微鏡購于德國萊卡公司：低溫冷凍干燥機(jī)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;二氧化碳培養(yǎng)箱（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 黃連水提物的制備

將1 kg雞爪黃連用超速粉碎機(jī)粉碎，用1∶6的水溶液浸泡4 h，隨后放于-30℃冰箱，冷凍24 h，解凍后，離心，取上清，用分子柱過濾，冷凍干燥后得干粉。

1.3.2 紫外光譜分析

水提物經(jīng)紫外200～700 nm波長掃描，在260、340 nm有明顯吸收峰。

1.3.3 提取物對(duì)A-431細(xì)胞的凋亡、增殖影響

1.3.3.1 將A-431細(xì)胞培養(yǎng)于含1%雙抗10%胎牛血清的DMEM常規(guī)培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后，轉(zhuǎn)接于96孔板中，每孔加入4×105/mL細(xì)胞懸液100 μL，培養(yǎng)12 h后，分組。未加藥物的為對(duì)照組，黃連水提取物設(shè)4個(gè)劑量，均為藥物組，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)復(fù)孔，劑量為6.3、12.5、25、50 μg/μL。分別培養(yǎng)24、48、72 h，然后分別在不同的時(shí)間段，加入10 μL的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在490 nm處讀OD值。計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.3.3.2 選取細(xì)胞抑制率最佳的25 μg/μL藥物組，加藥培養(yǎng)48 h后，用倒置顯微鏡觀察藥物作用的形態(tài)變化。經(jīng)Tunel染色后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的熒光現(xiàn)象。

1.3.3.3 用藥物濃度為25 μg/孔的黃連水提物作用A431細(xì)胞，分別收集0、12、24 h和48 h細(xì)胞，檢測(cè)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫外吸光光譜分析法分析黃連水提物成分

黃連水提物經(jīng)紫外200～700 nm波長掃描，出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰：在260 nm有最高吸收峰值，為核酸物質(zhì)，340 nm出現(xiàn)高吸收峰，為生物堿（圖1）。

2.2 MTT檢測(cè)黃連水提物對(duì)細(xì)胞抑制作用的最佳濃度和時(shí)間

采用不同濃度的黃連水提取物作用于A431細(xì)胞，于24、48 h和72 h檢測(cè)細(xì)胞的增殖率。結(jié)果顯示，隨著作用時(shí)間的增加，在6.3 μg/μL的黃連水提物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率在24 h和48 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而72 h的抑制率顯著高于24 h和48 h（P < 0.05），12.5 μg/μL的黃連水提物作用72 h的抑制率顯著高于24 h和48 h（P < 0.05），而48 h的顯著高于24 h的抑制率（P < 0.05）。25 μg/μL和50 μg/μL的黃連水提取物作用72 h和48 h的抑制率顯著高于24 h（P < 0.05），而72 h和48 h的抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。隨著作用濃度的增加細(xì)胞的抑制率逐漸升高，在48 h時(shí)達(dá)到最高，與72 h的最高值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。提示25 μg/μL黃連水提取物作用48 h對(duì)A431細(xì)胞的抑制率已達(dá)到最佳。見表1。

2.3 細(xì)胞凋亡現(xiàn)象

2.3.1 光鏡下的細(xì)胞形態(tài)現(xiàn)象

顯微鏡下，對(duì)照組細(xì)胞生長旺盛，分布稠密，形態(tài)飽滿呈鵝卵石型。25 μg/μL黃連水提取物孵育48 h組，細(xì)胞分布稀疏，體積明顯縮小，多數(shù)細(xì)胞呈圓形，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加。見圖2。

2.3.2 Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化

Tunel顯示25 μg/μL孵育48 h組核定位處較對(duì)照組綠光比藍(lán)光比例明顯增多，提示細(xì)胞核DNA產(chǎn)生大量斷裂，3′-OH暴露，細(xì)胞大量凋亡。見圖3（封四）。

2.3.3 25 μg/μL黃連水提取物在不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2表達(dá)比較

為了進(jìn)一步研究黃連水取物對(duì)A431細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究利用Western blot檢測(cè)了Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Bcl-2在25 μg/μL黃連水提取物孵育0、12、24 h和48 h后在蛋白水平的表達(dá)。提示Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9在24 h和48 h的表達(dá)量顯著升高（P < 0.05）。而Bcl-2在24 h和48 h的表達(dá)量則顯著低于其他時(shí)間的表達(dá)量（P < 0.05）。用Western blot檢測(cè)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Bcl-2在25 μg/μL黃連水提物孵育0、12、24 h和48 h后在蛋白水平的表達(dá)。見表2、圖4。

3 討論

天然植物提取物在腫瘤治療和預(yù)防中起到積極作用，可以抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，減輕放化療的不良反應(yīng)，可改善人體抗腫瘤藥物的耐藥性，在治療腫瘤中具有重要作用[8-9]。

黃連是一味具有廣泛藥效作用的中藥，隨著科技的進(jìn)步，新的藥效不斷被發(fā)現(xiàn)，黃連的根莖均含多種異喹啉類生物堿[10]，近年研究[11-12]表明鹽酸小檗堿的較多，具有抗菌、抗病毒、利膽、抗腫瘤等藥理作用。本研究發(fā)現(xiàn)，采用低溫提法獲取黃連水提取物，有效地保留了黃連水提物的有效成分，獲取高純度的濃縮提取物，可以使人皮膚腫瘤細(xì)胞A431細(xì)胞出現(xiàn)程度不同的凋亡，證明中草藥黃連水提小分子提取物具有抑制皮膚腫瘤的作用，為皮膚腫瘤的治療開發(fā)新的治療方法，且表明在黃連中含有除小檗堿之外的其他抗腫瘤活性物質(zhì)存在。嚴(yán)淑[13]運(yùn)用體外抗腫瘤方法，發(fā)現(xiàn)黃連總堿對(duì)人胃癌細(xì)胞株BGC-823、MKN-45體外具有明顯抑制增殖的作用。黃林清[14]發(fā)現(xiàn)黃連能具有抗食道癌的作用，這種作用與小桑堿調(diào)節(jié)腫瘤lL-6的產(chǎn)生水平是相關(guān)的。這提示黃連對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。它涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等作用[15]，同時(shí)是受多種凋亡相關(guān)蛋白調(diào)控的復(fù)雜生化反應(yīng)。凋亡相關(guān)蛋白的異常表達(dá)及功能改變與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，是影響腫瘤治療效果的重要因素[16-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連小分子水提物可以使外源性凋亡信號(hào)Caspase-8、內(nèi)源性凋亡信號(hào)Caspase-9顯著升高，并抑制Bcl-2的表達(dá)量，從而激活剪切后的Caspase-3凋亡效應(yīng)蛋白，導(dǎo)致凋亡。中提示黃連水提小分子提取物能通過多渠道，多靶點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，抑制A431細(xì)胞增殖。本研究進(jìn)一步明確了其在治療皮膚腫瘤中的作用機(jī)制，擴(kuò)大民族醫(yī)藥用途，為皮膚腫瘤的治療提供了新的研究方向。

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（收稿日期：2018-07-16? 本文編輯：封? ?華）