孫勇，孫曉智，張炳遠(yuǎn)

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽(yáng) 550001；青島大學(xué)附屬醫(yī)院 2.血管外科 3.肝膽外科，山東 青島 266000）

膽管癌是一類起源于膽管黏膜上皮細(xì)胞的消化道惡性腫瘤，其惡性程度極高，約占消化道惡性腫瘤的3%[1-3]，該病好發(fā)年齡段為50～70歲，男女發(fā)病比例為1.5:1[4]，基于其解剖位置，可分為肝內(nèi)膽管癌、肝門膽管癌及遠(yuǎn)端膽管癌。膽管癌患者早期多無(wú)典型臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者主要以梗阻性黃疸、腹痛、小便顏色深黃等為主訴于醫(yī)院就診，而一旦出現(xiàn)上述癥狀，則多提示已處于中晚期。因?qū)Ψ呕煵幻舾校词箲?yīng)用指南推薦的吉西他濱聯(lián)合順鉑化療方案，平均生存期也不足12個(gè)月[5-6]，因此外科手術(shù)仍是所有類型膽管癌的優(yōu)先選擇。據(jù)報(bào)道，膽管癌患者在確診后如不治療，其生存時(shí)間約為3～4個(gè)月，而手術(shù)后的患者多在2年內(nèi)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]，以至其5年生存率仍不足10%[8-9]。因此，深入了解膽管癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制，對(duì)提高膽管癌患者的早期診斷率、療效、改善患者預(yù)后將起到重要作用。

小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifiers，SUMO）是一類在結(jié)構(gòu)上與泛素相似的蛋白，廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，它不僅參與蛋白的翻譯后修飾，而且還能調(diào)控離子通道、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、核質(zhì)轉(zhuǎn)輸、細(xì)胞衰老和凋亡等細(xì)胞過(guò)程。多種致癌基因和腫瘤抑制基因，如KAP1、Sp3、p300、c-Jun、myc、AP-2、Ets-1、Erm、P53等，已被報(bào)道為SUMO蛋白的底物，其中SUMO化能夠促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄激活和抑制[10-12]。研究[13-15]表明SUMO化途徑的失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密不可分，并且為腫瘤細(xì)胞的增殖和體內(nèi)生長(zhǎng)所必需。SUMO激活酶E1是SUMO化過(guò)程中唯一的激活酶，由SUMO活化酶亞單位2（SAE2）（也稱UBA2）和亞單位1（SAE1）組成，2個(gè)亞基具有獨(dú)特的功能和調(diào)控機(jī)制，但兩者只有結(jié)合在一起，SUMO激活酶E1才具有催化活性[16]。SAE2為SUMO激活酶E1必不可少的重要組成亞基，介導(dǎo)SUMO修飾的第一步，其表達(dá)異?？梢餝UMO化途徑的紊亂，為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供有利條件[17-18]。本文將探討SAE2在膽管癌組織中的表達(dá)情況，并探討其與患者臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院2009年1月—2011年12月經(jīng)手術(shù)切除后石蠟包埋的膽管病理標(biāo)本 80例，其中膽管癌60例，正常膽管20例。60例膽管癌組織分型均為腺癌。其中男41例，女19例，年齡30～82歲，平均年齡61.2歲；腫瘤直徑1.0～ 7.0 cm，平均直徑2.89 cm；按病理分化程度：高分化9例，中分化29例,低分化22例；按第7版TNM分期：T1+T2期20例，T3+T4期40例；按腫瘤位置：肝門膽管癌42例，中下段膽管癌18例。納入本次實(shí)驗(yàn)的患者術(shù)前均未行放、化療，且為首次就診。所有標(biāo)本均采用10%中性甲醛溶液固定后，石蠟包埋保存。對(duì)60例膽管癌患者進(jìn)行隨訪，起始時(shí)間為外科手術(shù)日，截止于2015年7月31日。

1.2 主要試劑

鼠抗人SAE2單克隆抗體購(gòu)自O(shè)rigene公司，PV-6000檢測(cè)試劑盒和濃縮DAB檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將石蠟包埋的膽管癌及正常膽管標(biāo)本連續(xù)切片3張（1張用于HE染色光鏡篩選，2張用于免疫組化檢測(cè)），厚度為4 μm。采用PV-6000二步法檢測(cè)60例膽管癌及20例正常膽管組織中SAE2的表達(dá)情況，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)操作明書進(jìn)行。病理切片經(jīng)過(guò)脫蠟和水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)；阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，免疫組化筆圈定待測(cè)區(qū)；于圈定區(qū)域滴加適量鼠抗人SAE2單克隆抗體（一抗），室溫孵育；向待測(cè)區(qū)域滴加適量辣根酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物（二抗），室溫孵育；向切片待測(cè)區(qū)滴加適量已配制好的DAB顯色劑顯色；蘇木精復(fù)染；酒精梯度脫水，置入二甲苯溶液中透明化，電熱恒溫箱中烘干，滴加適量中性樹(shù)膠，封片，置于通風(fēng)櫥中晾干；取出切片，顯微鏡下觀察（每批實(shí)驗(yàn)均以試劑盒提供的陽(yáng)性質(zhì)控片為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照）。

1.4 結(jié)果及判定

以細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色的強(qiáng)度和染色面積作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)隨機(jī)選擇8個(gè)視野（400倍）的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)：無(wú)細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)染色或者細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)染色數(shù)量＜10%膽管癌細(xì)胞（0分）；染色模糊且可見(jiàn)染色細(xì)胞數(shù)量＞10%膽管癌細(xì)胞（1分）；中等染色細(xì)胞數(shù)量＞10%膽管癌細(xì)胞（2分）；細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核強(qiáng)染色細(xì)胞數(shù)量＞10%膽管癌細(xì)胞（3分）。（以上結(jié)果均由有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生雙盲法觀察并確定，0分和1分為低表達(dá)：陰性，2分和3分為高表達(dá)：陽(yáng)性）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分別用χ2檢驗(yàn)、Kaplan-Meier單因素生存分析、Logrank檢驗(yàn)、Cox多因素回歸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均行雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SAE2在膽管癌及正常膽管組織中的表達(dá)

鏡下發(fā)現(xiàn)SAE2的表達(dá)主要集中在細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中也可見(jiàn)其少量表達(dá)；20例正常膽管組織中，陽(yáng)性表達(dá)率為30.00%（6/20），60例膽管癌組織中，陽(yáng)性表達(dá)率為71.67%（43/60），兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.972，P＜0.001）（圖1）(表1）。

圖1 免疫組化檢測(cè)SAE2蛋白表達(dá)（×400）Figure1 Immunohistochemical staining for SAE2 protein expression (×400)

表1 SAE2在膽管癌及正常膽管組織組織中陽(yáng)性表達(dá)率比較[n（%）]Table1 Comparison of the positive expression rates of SAE2 in cholangiocarcinoma and normal bile duct tissue [n (%)]

2.2 SAE2的表達(dá)與膽管癌患者臨床病理因素的關(guān)系

對(duì)60例膽管癌組織中SAE2的表達(dá)和患者的臨床病理因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，SAE2的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤部位及直徑無(wú)關(guān)（均P＞0.05），而與腫瘤的病理分化程度和TNM分期明顯有關(guān)（均P＜0.05）（表2）。

表2 SAE2的表達(dá)與膽管癌患者臨床病理因素的關(guān)系 [n（%）]Table2 Relations of SAE2 expression with the clinicopathologic factors of the patients with cholangiocarcinoma [n (%)]

2.3 SAE2的表達(dá)與膽管癌患者預(yù)后的關(guān)系

本組60例膽管癌患者均獲得隨訪，其中6例因未能觀察到結(jié)局事件而出現(xiàn)刪失數(shù)據(jù)，刪失數(shù)據(jù)占10%（6/60）。SAE2表達(dá)陰性患者的中位生存時(shí)間為30.7個(gè)月，SAE2表達(dá)陽(yáng)性患者的中位生存時(shí)間為13.0個(gè)月，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.805，P＜0.001）。SAE2陰性表達(dá)患者的預(yù)后明顯優(yōu)于陽(yáng)性表達(dá)的患者 （圖2）。單因素生存分析顯示：膽管癌患者的預(yù)后與SAE2的表達(dá)和TNM分期有關(guān)（均P＜0.001），與腫瘤的病理分化程度無(wú)關(guān)（P＞0.05）；Cox多因素回歸分析顯示，SAE2的表達(dá)和TNM分期是膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（表3-4）。

圖2 SAE2陽(yáng)性與陰性表達(dá)膽管癌患者的生存曲線Figure2 Survival curves of the cholangiocarcinoma patients with positive and negative SAE2 expressions

表3 膽管癌患者預(yù)后相關(guān)因素的單因素分析Table3 Univariate analysis of the factors for the prognosis of cholangiocarcinoma patients

表4 影響患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析Table4 Multivariate Cox analysis of the factors affecting the prognosis of cholangiocarcinoma patients

3 討 論

近年來(lái)，隨著外科手術(shù)的發(fā)展，膽管癌的可切除性及R0切除率逐步上升，但因其低診斷率、易轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)等生物學(xué)特征，加之其高度促結(jié)締組織增生、豐富的腫瘤微環(huán)境的廣泛支持，其術(shù)后復(fù)發(fā)率非常高[19]，預(yù)后仍然不容樂(lè)觀。目前已有臨床研究證實(shí)，在膽道腫瘤中，針對(duì)異常表達(dá)基因的靶向藥物對(duì)膽道腫瘤有明顯抑制效果[20-21]。為提高膽管癌患者的預(yù)后，因此膽管癌的分子生物學(xué)特征成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，SAE2在多種腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后等密切相關(guān)[22-24]?；谏鲜鲅芯浚覀兺茰y(cè)SAE2在膽管癌組織中高表達(dá)。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)60例膽管癌及20例正常膽管組織中SAE2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SAE2的表達(dá)主要集中在細(xì)胞核，SAE2在膽管癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常膽管組織。

浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是造成膽管癌患者預(yù)后不佳的重要影響因素。Cheng等[25]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SAE2在大腸癌中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，敲低SAE2的表達(dá)可顯著抑制癌細(xì)胞的增值、遷移和侵襲，提示SAE2參與了結(jié)腸癌的進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且患者的不良預(yù)后有關(guān)。Shao課題組[26]發(fā)現(xiàn)SAE2的表達(dá)水平與腫瘤的浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，敲低SAE2的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，且SAE2的表達(dá)水平是患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。Liu等[27]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SAE2在小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，下調(diào)SAE2的表達(dá)，癌細(xì)胞表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩和凋亡增加，并可抑制腫瘤遷移和侵襲，同時(shí)還能增加癌細(xì)胞對(duì)依托泊苷和順鉑的化療敏感性。Lee等[28]發(fā)現(xiàn)SAE2在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)且與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了60例膽管癌患者的臨床病理因素，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SAE2的表達(dá)與腫瘤的病理分化程度和TNM分期有關(guān)。對(duì)60例膽管癌患者的生存時(shí)間進(jìn)行Kaplan-Meier單因素及Cox多因素回歸分析顯示，SAE2的表達(dá)水平和腫瘤的TNM分期是患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，SAE2低表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著高于高表達(dá)患者。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SAE2在膽管癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的病理分化程度和TNM分期有關(guān)，SAE2的表達(dá)是膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，且與患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，提示SAE2可能參與了膽管癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程，但其分子生物學(xué)機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。