謝偉選，柏楊，李福利，劉偉偉，朱振成，祝夢(mèng)嬌，朱慶洲，周志華，趙海濱，羅昆侖,

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)無錫臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214044；中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院 2.肝膽外科 3.病理科，江蘇 無錫 214044）

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的原發(fā)性腫瘤，在原發(fā)性肝臟腫瘤中發(fā)病率排名第二[1-2]。近年來，我國(guó)ICC發(fā)病率逐步升高，其發(fā)病原因可能與膽管結(jié)石、肝炎病毒、膽管囊腫及肝硬化等因素有關(guān)。肝內(nèi)膽管結(jié)石能夠誘發(fā)ICC，其具體機(jī)制目前尚不清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為結(jié)石的機(jī)械性刺激以及膽汁淤積引起的膽管慢性炎癥能誘導(dǎo)ICC的發(fā)生[3-4]。由于ICC起病隱匿，易發(fā)生神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，該疾病對(duì)放化療敏感性低，也缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物，目前，根治性手術(shù)切除是治療ICC最重要的方法，但術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差[5-7]。因此，探討ICC術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，探索新的監(jiān)測(cè)標(biāo)志物，這對(duì)于提高ICC的早期診斷、臨床治療及降低腫瘤病死率有著重大意義。

TGF-β1是一種參與胚胎發(fā)育、器官形成、免疫反應(yīng)等生理過程的重要細(xì)胞因子，也參與創(chuàng)傷后組織修復(fù)及組織纖維化過程的調(diào)控。survivin基因是一種具有抑制細(xì)胞凋亡并可以通過有絲分裂促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞異常增殖的凋亡抑制因子[8-9]。caspase-3是caspase家族中控制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，通過線粒體途徑和Fas/TNFR1介導(dǎo)的受體途徑來控制機(jī)體細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[10]。目前，關(guān)于TGF-β1、survivin與caspase-3在ICC組織中的研究文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)ICC組織中TGF-β1、survivin與caspase-3的表達(dá)及相關(guān)性，并探討其與ICC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床上治療肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)ICC的治療尋找新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集我院病理科2013—2019年肝內(nèi)膽管組織蠟塊標(biāo)本共112例，其中為肝內(nèi)膽管結(jié)石并ICC的膽管組織標(biāo)本（腫瘤組），包括男23例，女 29例；平均年齡和中位年齡分別為61.77歲和62歲，年齡范圍為39～89歲。30例為肝內(nèi)膽管結(jié)石切除的肝內(nèi)膽管組織且鏡下僅發(fā)現(xiàn)慢性炎癥的膽管組織標(biāo)本（炎癥組），包括男17例，女13例；平均年齡和中位年齡分別為55.77歲和56.5歲，年齡范圍為30～84歲。取同期因肝臟損傷手術(shù)切除的30例患者正常肝膽管組織標(biāo)本作為對(duì)照（正常組），包括男14例，女16例；平均年齡和中位年齡分別為52.43歲和54歲，年齡范圍為26～82歲。3組患者性別、年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，分別作HE及免疫組化染色。HE切片由2名專業(yè)水平較高的病理科主治醫(yī)師復(fù)診證實(shí)。

1.2 試劑和儀器

免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；濃縮型兔抗人TGF-β1抗體、濃縮型兔抗人caspase-3抗體購(gòu)自ABclonal公司；濃縮型兔抗人survivin單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法（SP法） 石蠟標(biāo)本切片，每份標(biāo)本取4份切片，切片厚度為4 μm，常規(guī)烤片、脫蠟、梯度酒精脫水。3%H2O2孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；蒸餾水沖洗，PBS沖洗5 min×3次；切片至于EDTA緩沖液中行高壓抗原熱修復(fù)預(yù)處理，分別加入一抗工作液，其中TGF-β1一抗按1:100稀釋，survivin一抗按1:50稀釋，caspase-3一抗按1:100稀釋，4 ℃恒溫下過夜，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組（以PBS代替），滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液后常溫避光孵育 30 min，經(jīng)PBS沖洗5 min×3次；滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察顯色情況，蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木素復(fù)染5 min，蒸餾水沖洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，以中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下判定染色結(jié)果。

1.3.2 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[11-12]TGF-β1陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)和/或核呈淡黃色細(xì)顆粒者明顯高于背景色；survivin陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)和/或核呈淡黃色細(xì)顆粒者明顯高于背景色。caspase-3陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)和/或核呈淡黃色細(xì)顆粒者明顯高于背景色。由專業(yè)水平較高的病理科主治醫(yī)師進(jìn)行切片觀察，并對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，醫(yī)師僅作為觀察者，不告知切片病理情況。采用半定量積分法判定結(jié)果：染色強(qiáng)度評(píng)分為4級(jí)，0分，無著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：顯微鏡下隨機(jī)選取 10個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取10個(gè)視野的百分比平均數(shù)。0分，陽(yáng)性細(xì)胞＜10%；1分，陽(yáng)性細(xì)胞：10%～25%；2分，陽(yáng)性細(xì)胞：26%～50%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞：51%～75%；4分，陽(yáng)性細(xì)胞：＞75%；染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分相乘，＜2分為陰性（-），≥2分為陽(yáng)性（+）。

1.4 隨訪

術(shù)后通過門診隨訪、電話回訪（回訪日期截止2019年2月）了解患者生存、術(shù)后并發(fā)癥等情況。截止目前，隨訪時(shí)間最短為1個(gè)月，最長(zhǎng)為66個(gè)月。其中失訪患者有6例，失訪患者未納入研究。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

選取SPSS 19.0來分析數(shù)據(jù)，各組陽(yáng)性表達(dá)情況比較選取χ2檢驗(yàn)，兩兩比較選取χ2分割法，各組樣本間計(jì)量資料比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果分析

各種蛋白在3種組織中均有不同程度的表達(dá)（圖1）。半定量分析顯示，各組間TGF-β1表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；腫瘤組與炎癥組比較（χ2=8.747）、腫瘤組與正常組比較（χ2=24.273）、炎癥組與正常對(duì)照組比較（χ2=4.022），兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；TGF-β1的表達(dá)強(qiáng)弱關(guān)系為：腫瘤組＞炎癥組＞正常組。各組間survivin表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；腫瘤組與炎癥組比較（χ2=5.306）、腫瘤組與正常對(duì)照組比較（χ2=21.026）、炎癥組與正常組比較（χ2=5.079），兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；survivin的表達(dá)強(qiáng)弱關(guān)系為：腫瘤組＞炎癥組＞正常組。各組間caspase-3表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；腫瘤組與炎癥組比較（χ2=4.518）、腫瘤組與正常對(duì)照組比較（χ2=17.994）、炎癥組與正常組比較（χ2=4.812），兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；caspase-3的表達(dá)強(qiáng)弱關(guān)系為：腫瘤組＜炎癥組＜正常組（表1）。

圖1 免疫組化檢測(cè)TGF-β1、survivin與caspase-3的表達(dá)（×200）Figure1 Immunohistological staining for the expressions of TGF-β1,survivin and caspase-3 (×200)

表1 各組TGF-β1、survivin與caspase-3表達(dá)的比較[n（%）]Table1 Comparison of the expressions of TGF-β1,survivin and caspase-3 among groups [n (%)]

2.2 ICC組織中TGF-β1、survivin和caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的相關(guān)性

ICC組織中TGF-β1表達(dá)與caspase-3蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.890，P＜0.01），TGF-β1表達(dá)與survivin表達(dá)呈明顯正相關(guān)（r=0.917，P＜0.01），survivin表達(dá)與caspase-3表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.894，P＜0.01）（圖2）。

圖2 TGF-β1、survivin與caspase-3表達(dá)相關(guān)性分析Figure2 Analysis of the correlations among the expression of TGF-β1,surviving and caspase-3

2.3 TGF-β1、survivin與caspase-3蛋白表達(dá)與ICC臨床病理特征的關(guān)系

TGF-β1、survivin與caspase-3陽(yáng)性表達(dá)均與患者的年齡、性別、HbsAg表達(dá)情況、CA19-9水平、膽道結(jié)石等因素?zé)o關(guān)（均P＞0.05）；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度、AFP水平、腫瘤最大直徑有關(guān)（均P＜0.05）。其中，TGF-β1與caspase-3陽(yáng)性表達(dá)與患者的腫瘤是否侵犯血管有關(guān)（均P＜0.05）（表2）。

表2 TGF-β1、survivin與caspase-3表達(dá)與52例ICC患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table2 Relations of the expressions of of TGF-β1,surviving and caspase-3 with clinicopathologic features of the 52 ICC patients [n (%)]

2.4 ICC患者預(yù)后與各種臨床病理參數(shù)關(guān)系的單因素分析

單因素分析顯示，ICC患者術(shù)后預(yù)后與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化情況、血管侵犯、腫瘤最大直徑、R0切除、CA19-9、AFP、TGF-β1、survivin及caspase-3表達(dá)等因素有關(guān)（均P＜0.05）；與年齡、性別、肝硬化、膽道結(jié)石、HbsAg表達(dá)等因素?zé)o關(guān)（均P＞0.05）（表3）。

表3 ICC患者預(yù)后與各種臨床病理參數(shù)關(guān)系的單因素分析Table3 Univariate analysis of the relations of the clinicopathologic parameters with the prognosis of the ICC patients

2.5 ICC患者預(yù)后與各種臨床病理參數(shù)關(guān)系的多因素分析

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析表明是否R0切除、腫瘤分化情況、TGF-β1、survivin及caspase-3表達(dá)等因素是ICC患者術(shù)后生存期的獨(dú)立影響因素（均P＜0.05）（表4）。

表4 ICC患者預(yù)后與各種臨床病理參數(shù)關(guān)系的多因素分析Table4 Multivariate analysis of the relations of the clinicopathologic parameters with the prognosis of the ICC patients

2.6 TGF-β1、survivin及caspase-3表 達(dá) 與ICC患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系

對(duì)52例ICC患者采用電話方式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間自患者接受手術(shù)之日起至2019年3月，患者死亡或失訪日期（失訪8例）。分析結(jié)果顯示，TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)患者的生存率明顯低于TGF-β1陰性表達(dá)患者（χ2=13.192，P=0.001）；survivin陽(yáng)性表達(dá)患者的生存率明顯低于survivin陰性表達(dá)患者（χ2=10.536，P=0.002）；caspase-3陽(yáng)性表達(dá)患者的生存率明顯高于caspase-3陰性表達(dá)患者（χ2=5.469，P=0.023）（圖3）。

圖3 不同TGF-β1、survivin與caspase-3表達(dá)狀態(tài)ICC患者生存曲線Figure3 The survival curves of ICC patients with different expression statuses of TGF-β1,surviving and caspase-3

3 討 論

ICC的發(fā)生和發(fā)展是由多種因素共同參與、多步驟、多階段的一個(gè)復(fù)雜過程。ICC由于解剖位置特殊，起病不易發(fā)現(xiàn)，惡性程度高，預(yù)后差，與肝細(xì)胞肝癌相比更易發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與術(shù)后復(fù)發(fā)[13]。近年來，ICC的發(fā)病率逐年升高，由于該腫瘤異質(zhì)性強(qiáng)，早期診斷困難，外科手術(shù)是當(dāng)前可能治愈ICC的唯一的方法，但由于缺少有效的早期診斷方法，只有大約10%～15%的膽管癌患者適合手術(shù)治療[14]。然而術(shù)后總體預(yù)后較差，針對(duì)ICC早期診斷和早期治療的研究一直是臨床上的重要難題[15-17]。

TGF-β1在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著雙重作用，在腫瘤起始階段，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但是在腫瘤進(jìn)展期，則通過多種信號(hào)通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），促進(jìn)新生血管形成和腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。有文獻(xiàn)[18]報(bào)道，TGF-β1異常表達(dá)可影響ICC的惡性生物學(xué)行為，是判斷預(yù)后的重要指標(biāo)，同時(shí)還可以促進(jìn)EMT的發(fā)生，影響膽管癌的發(fā)生發(fā)展[19]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1在正常組、炎癥組和腫瘤組中均有表達(dá)，各組平均陽(yáng)性表達(dá)率分別是16.67%、40.0%、73.08%，TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)率在3組肝內(nèi)膽管組織中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），且本文通過多因素分析發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達(dá)水平是ICC患者術(shù)后生存期的不良獨(dú)立預(yù)后因素，TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者生存曲線差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.192，P=0.001），以上結(jié)果表明TGF-β1可作為ICC患者術(shù)后預(yù)后情況的獨(dú)立指標(biāo)之一。

survivin是目前已知最強(qiáng)的凋亡抑制因子，其表達(dá)跟腫瘤的分期及生物學(xué)功能有著重要聯(lián)系[20]。國(guó)內(nèi)學(xué)者秦興雷等[21]通過檢測(cè)膽管癌組織和癌旁組織中survivin蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝外膽管癌組織中survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于癌旁組織，兩者陽(yáng)性表達(dá)率分別為67.8%、20.0%。本研究結(jié)果顯示，ICC組織中的survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)高于炎癥組和正常組患者，分別為69.23%、43.33%、16.67%，這與以上報(bào)道結(jié)果相一致。另外，許鵬等[22]研究發(fā)現(xiàn)，survivin蛋白的表達(dá)水平還與腫瘤的TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤(rùn)呈正相關(guān)，與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)。Grabowski等[23]和Rohayem等[24]報(bào)道顯示，survivin蛋白的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)行為呈正相關(guān)，可作為監(jiān)測(cè)膽管癌患者術(shù)后預(yù)后情況的獨(dú)立指標(biāo)。這與本研究結(jié)果相一致，survivin陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者生存曲線差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.536，P=0.002），且通過多因素分析發(fā)現(xiàn)，survivin蛋白表達(dá)水平是ICC患者術(shù)后生存期的不良獨(dú)立預(yù)后因素。然而survivin是如何抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制至今仍存在巨大爭(zhēng)議，有研究[24-25]表明，survivin可能通過直接抑制凋亡終末效應(yīng)器caspase-3和caspase-7的活性阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程[26]；caspase-3是細(xì)胞凋亡通路中重要的執(zhí)行分子之一，也是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終效應(yīng)蛋白，被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的關(guān)鍵酶。在正常狀況下，細(xì)胞胞質(zhì)中的caspase-3無活性，但當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時(shí)，它才會(huì)被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[27]。Friman[28]研究發(fā)現(xiàn)caspase-3與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤惡性轉(zhuǎn)移的重要原因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，caspase-3蛋白在正常組膽管組織胞質(zhì)中表達(dá)，而在炎癥組和腫瘤組膽管組織陽(yáng)性表達(dá)率則明顯降低，在正常組、炎癥組、腫瘤組中平均陽(yáng)性表達(dá)率分別為90.0%、66.67%、42.31%，三者之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），本研究結(jié)果還顯示，caspase-3陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者生存曲線差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.469，P=0.023），survivin表達(dá)與caspase-3表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r= -0.894，P＜0.01）。這與李楊鈞等[29]研究結(jié)果相一致，他們認(rèn)為 survivin在膽管細(xì)胞癌中的陽(yáng)性表達(dá)率較高，但caspase-3較低，兩者呈負(fù)相關(guān)，考慮可能是survivin抑制了caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果表明survivin和caspase3的表達(dá)與ICC的發(fā)生存在密切關(guān)系，提示兩者在ICC中的惡性轉(zhuǎn)化及發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中起關(guān)鍵作用。這與盧昕等[30]研究結(jié)果相一致，他們認(rèn)為caspase-3和caspase-9在膽管癌組織中的表達(dá)水平和活性較低，這有利于膽管癌細(xì)胞逃逸，維持較高的增殖活性，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其中，survivin可以通過促進(jìn)procaspase-9的活化來阻止caspase-3的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)性ICC中TGF-β1、survivin陽(yáng)性表達(dá)率升高，兩者呈正相關(guān)，caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率降低，與前兩者呈負(fù)相關(guān)。TGF-β1、survivin與caspase-3基因在ICC中的臨床應(yīng)用價(jià)值得期待，有望成為ICC分子標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。監(jiān)測(cè)ICC組織中TGF-β1、survivin與caspase-3的水平，有助于判斷患者的預(yù)后。但是，關(guān)于三者在ICC發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。