寇曉琳, 謝 楠, 吳彩娥,, 范龔健,, 洑香香

(1.南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)又名青錢李、搖錢樹等，系胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(Cyclocarya)植物，是我國特有的單種屬植物，也是國家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一，屬三類保護(hù)植物.《中國中藥資源志要》[1]記載，其樹皮、葉均具有清熱消腫、止痛的功能，可用于治療頑癬[2].長期以來，江西、湖南等地的人們?nèi)∑淙~制作飲料，因其味甜，有清熱解暑、降血壓、降血糖等功能，又稱甜茶、神茶[3].2013年10月30日國家衛(wèi)計(jì)委正式批準(zhǔn)青錢柳葉為新食品原料，并規(guī)定其使用方式為“沖泡”.近年來，國內(nèi)外學(xué)者對青錢柳的種植、活性物質(zhì)提取以及膠囊沖劑等保健品開發(fā)進(jìn)行了廣泛研究[4-5].

植物內(nèi)生菌是指生活在植物組織內(nèi)而不引起任何直接、明顯植物病變的一大類微生物，包括寄生或共生在植物體內(nèi)的真菌和細(xì)菌，以及植物侵襲性腐生菌或植物機(jī)會(huì)致病菌[6].100多年前，Bacon et al[7]就從黑麥草種子中分離出第一株內(nèi)生真菌，但直到1993年Stierle et al[8]從短葉紅豆杉韌皮部分離到一株能產(chǎn)抗癌活性物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌才真正引起人們對植物內(nèi)生真菌的功能性質(zhì)的注意.近年來，植物內(nèi)生菌特別是藥用植物內(nèi)生菌，作為一種新的微生物資源引起了廣泛關(guān)注，人們從其代謝產(chǎn)物中分離出多種生物活性物質(zhì)，包括具有抗菌、抗腫瘤、殺蟲、免疫抑制、抗氧化等特點(diǎn)的天然化合物，其中不少是新物質(zhì)，具有特殊生物活性[9-12].黃酮類化合物是一類天然多酚化合物，具有抗氧化、清除自由基的功效，目前已證實(shí)其對動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松癥、糖尿病和某些癌癥有一定的治療效果[13].研究表明，植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似成分的活性物質(zhì)[14].張海龍等[15]、張婷等[16]及趙曉璐等[17]都從植物中分離出多株產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌.野生青錢柳的直接利用由于其屬于國家珍稀瀕危植物受到很大限制，不能滿足開發(fā)和應(yīng)用的需求，獲得其活性物質(zhì)的途徑有待進(jìn)一步的創(chuàng)新和拓寬，青錢柳活性內(nèi)生菌的開發(fā)研究意義重大.

本研究以江蘇鎮(zhèn)江的青錢柳為材料，采用組織分離的方法從植物的枝、葉、根、皮部位大量分離內(nèi)生真菌，研究青錢柳內(nèi)生真菌的多樣性及分布部位.通過抑菌活性跟蹤，篩選具有抑菌作用和產(chǎn)黃酮的青錢柳內(nèi)生真菌，研究青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對供試菌株的抑菌活性以及產(chǎn)黃酮的能力，旨在為青錢柳功能性內(nèi)生真菌進(jìn)一步的研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物、菌株與黃酮提取物 青錢柳植株枝、皮、葉、根均采自江蘇鎮(zhèn)江.大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)，由南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品實(shí)驗(yàn)室提供；白色念珠菌(Moniliaalbican)由南京師范大學(xué)食品實(shí)驗(yàn)室提供；青錢柳黃酮提取物由南京林業(yè)大學(xué)食品實(shí)驗(yàn)室提供；異槲皮苷標(biāo)品(純度≥98%)、山奈酚標(biāo)品(純度≥98%)、槲皮素標(biāo)品(純度≥90%)從SIGMA公司購入.

1.1.2 培養(yǎng)基 青錢柳內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基：馬丁氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基).青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯肉湯培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基).供試細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基.供試真菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[18].

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離 用自來水將無病害青錢柳的枝、皮、葉、根沖洗1 h，晾干后，將葉摘下，皮剝下，枝剪成5 cm長小段.在超凈工作臺上，按無菌操作方法進(jìn)行以下工作：先用5%的NaClO溶液浸泡材料5 min，再用75%的乙醇溶液浸泡30 s，用無菌水漂洗4次，無菌紗布蘸干水分，剪去枝條和根部兩頭褐變部分，將其剪成0.5 cm小段，去除木質(zhì)部，保留韌皮部.將韌皮部、葉片和樹皮剪成0.5 cm×0.5 cm小片.把處理過的各部分組織分別植入PDA培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基平板中，每皿植入4～5片，置于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，所有樣品在4 h內(nèi)完成內(nèi)生真菌的分離工作，每種處理設(shè)3組重復(fù).24 h觀察一次，待枝、葉、根、皮切面處長出菌絲后，挑取其尖端部分移至新的PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)，經(jīng)反復(fù)幾次純化后，即得到青錢柳內(nèi)生真菌純培養(yǎng)物.對照試驗(yàn)：將表面消毒后的枝、皮、葉、根不作切割，置相同條件下培養(yǎng)，結(jié)果無任何微生物長出，證明表面消毒徹底，分離到的真菌是青錢柳的內(nèi)生真菌.分離純化后，于4 ℃保存?zhèn)溆肹19-21].

1.2.2 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)觀察 觀察28 ℃下培養(yǎng)4～7 d的內(nèi)生真菌菌落形態(tài)特征.挑取純化的尖端菌絲，用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液染色，進(jìn)行常規(guī)鏡檢.參照《真菌鑒定手冊》[22]及相關(guān)文獻(xiàn)[23-25]對分離的內(nèi)生真菌進(jìn)行顯微形態(tài)特征的觀察和初步分類.

1.2.3 內(nèi)生真菌胞內(nèi)產(chǎn)物的提取 將內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)接到裝有100 mL PDA液的250 mL三角瓶中，放在恒溫?fù)u床上，在28 ℃、150 r·min-1的條件下培養(yǎng)7～10 d，同時(shí)留取空白培養(yǎng)基作對照.將菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，離心后量體積，將其濃縮30倍后用0.22 μm的濾膜過濾，得到胞內(nèi)產(chǎn)物濃縮液；空白培養(yǎng)基離心后，做相同處理，作為對照發(fā)酵濃縮液，備用[26].

1.2.4 內(nèi)生真菌發(fā)酵液制備 使用接種針挑取枝、皮、葉、根內(nèi)生菌培養(yǎng)基中面積為0.5 cm×0.5 cm平板培養(yǎng)物接到發(fā)酵瓶中，置于28 ℃、140 r·min-1的恒溫?fù)u床上繼續(xù)培養(yǎng)7 d.發(fā)酵結(jié)束后，用超聲波細(xì)胞破碎儀對發(fā)酵瓶中菌體進(jìn)行破碎，每瓶破碎30 min，使用甲醇靜置浸泡24 h.浸提后的溶液在4 000 r·min-1下，離心15 min后收集浸提液，于60 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮樣品得棕色粘稠物，加入70%的甲醇充分混勻，定容至5 mL后備用.

1.2.5 抑菌試驗(yàn) 以常見的2種細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球)和1種真菌(白色念珠菌)為檢測菌，采用濾紙片法檢測濃縮液的抑菌活性[27].方法為：分別取1.2.3中的胞內(nèi)產(chǎn)物濃縮液5 mL于無菌具塞試管內(nèi)，取直徑為10 mm的濾紙片若干放入試管中，使其充分吸收；然后在無菌操作臺上，用鑷子夾取略微風(fēng)干后的濾紙片平放于含有測試菌的培養(yǎng)皿中，測試各內(nèi)生真菌的發(fā)酵液和其菌絲提取液(從內(nèi)生真菌培養(yǎng)基中挑取不同部位內(nèi)生真菌與5 mL無菌水混合)對3種測試菌的抑菌效果；同時(shí)，分別取5 mL上述對照發(fā)酵濃縮液和無菌水于試管中，浸泡濾紙后，作為對照.將制好后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)皿在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，將制好的白色念珠菌的培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，然后觀察，測其抑菌圈大小，并拍照記錄.

抑菌活性表示方法：濾紙片直徑10 mm,“-”表示無抑菌圈，“+”表示抑菌圈直徑<5 mm,“++”表示5 mm≤抑菌圈直徑<10 mm，“+++”表示抑菌圈直徑≥10 mm.抑菌活性以抑菌圈直徑的大小進(jìn)行衡量,其中，抑菌圈直徑等于抑菌外徑與濾紙片直徑之差[28].

1.2.6 顯色反應(yīng) 硼酸顯色反應(yīng)：取1.2.4制備的發(fā)酵液5 mL置于試管中，加入2%的硼酸溶液數(shù)滴，置于振蕩器上搖勻，靜置30 min觀察有無棕黃色出現(xiàn)，并拍照記錄.3% AlCl3顯色反應(yīng)：取樣品1滴置于濾紙中央，并在濾紙表面噴灑3% AlCl3乙醇溶液，自然風(fēng)干后，放在紫外燈下觀察有無黃綠色熒光，并拍照記錄.4% NaOH顯色反應(yīng)：取青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵液2 mL置于試管中，加入4% NaOH溶液數(shù)滴，置于振蕩器上搖勻，靜置30 min觀察有無黃色出現(xiàn)，并拍照記錄[29].

1.2.7 薄層層析 對青錢柳內(nèi)生真菌所產(chǎn)黃酮進(jìn)行薄層層析，采用硅膠G薄板，選用20種展開劑，3% AlCl3乙醇溶液(顯色劑)，其組分比例見表1[30-33].

表1 薄層層析的展開劑組分及比例Table 1 Composition and ratio of developers for thin layer chromatography

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)特征及初步分類

本試驗(yàn)共從青錢柳中共分離獲得內(nèi)生真菌共67株.經(jīng)肉眼觀察菌落表面形態(tài)，并結(jié)合光學(xué)顯微鏡觀察其微觀特征，初步判定分離得到的內(nèi)生真菌分別屬于3綱4目6科10屬，其特征及分類見表2，10個(gè)代表性菌株的形態(tài)特征見圖1.

2.2 青錢柳內(nèi)生真菌的分布

2.2.1 不同組織中內(nèi)生真菌的分離結(jié)果 如表3所示，從青錢柳的枝、皮、葉、根4個(gè)部位中分離獲得的67株內(nèi)生真菌中，根部分布的內(nèi)生真菌從數(shù)量和種屬上都占優(yōu)勢，其內(nèi)生真菌共9屬27株，占分離菌株總數(shù)的40.3%，以木霉屬為優(yōu)勢菌群，占根部菌株數(shù)的25.9% ；枝部內(nèi)生真菌共7屬14株，占分離菌株總數(shù)的20.9%，以鐮刀菌屬為優(yōu)勢菌群，占枝部菌株數(shù)的35.7%；皮部內(nèi)生真菌共8屬19株，占分離菌株總數(shù)的28.4%，以鏈格孢屬為優(yōu)勢菌群，占皮部總菌株數(shù)的26.3%；葉部內(nèi)生真菌共6屬7株，占分離總菌株數(shù)的10.4%.

表2 青錢柳內(nèi)生真菌的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of endophytic fungi

A:木霉屬×400;B:青霉屬×1000;C:地霉屬×400;D:鏈格孢屬×1000;E:鐮刀菌屬×1000;F:刺盤孢屬×400;G:絲核菌屬×400;H:擬青霉孢屬×1000;I:根霉屬×100;J:棒束梗霉屬×1000.圖1 青錢柳內(nèi)生真菌的個(gè)體形態(tài)Fig.1 Individual form of endophytic fungi isolated from Cyclocaryapaliurus

表3 青錢柳不同組織內(nèi)生真菌的分布Table 3 Distribution of endophytic fungi in different organs of Cyclocaryapaliurus

表4 不同培養(yǎng)基中內(nèi)生真菌的分布Table 4 Distribution of endophytic fungi in different culture mediums

2.2.2 不同培養(yǎng)基內(nèi)生真菌的分離結(jié)果 如表4所示，馬丁氏培養(yǎng)基共分離得到31株，分離頻率為46.3%，其優(yōu)勢菌群為鏈格孢屬；察氏培養(yǎng)基共分離得到15株，分離頻率為22.4%，鐮刀菌屬為優(yōu)勢菌群；PDA培養(yǎng)基中共分離得到21株，分離頻率為31.3%，木霉屬為優(yōu)勢菌群.馬丁氏培養(yǎng)基分離得到的菌株雖然較多，但是真菌的種類只有6種；察氏培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)少，但菌屬種類較多，達(dá)到9種，且棒束梗霉屬、絲核菌屬只在察氏培養(yǎng)基中有發(fā)現(xiàn).

2.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

從67株內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性測試結(jié)果(表5)可以看出，其發(fā)酵產(chǎn)物對至少1種指示菌有抑制作用的菌共有13株，占總分離菌株的19.4%；對3種指示菌均有抑制作用的菌株有7株，占總分離菌株的10.4%.青錢柳內(nèi)生真菌對金黃色葡萄球菌有抑菌作用的菌株最多，有10株，占總分離菌株的14.9%，抑制白色念珠菌的菌株最少，為8株，占總分離菌株的11.9%.抑菌效果顯著的是編號為PP03、PP08、PP11、PP19、PZ11、PG07、PG11的7株青錢柳內(nèi)生真菌.這些內(nèi)生真菌抑菌譜廣，而抑菌效果最顯著的是編號為PP08和PG11的兩株青錢柳內(nèi)生真菌.其中PP08屬于青霉屬，PG11屬于鏈格孢屬.其發(fā)酵產(chǎn)物對指示菌的抑菌圈直徑均大于5 mm，其中PP08胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到14.5 mm，PG11胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物對于白色念珠菌的抑菌直徑達(dá)到13.2 mm(圖2)，表明其具有顯著的抑菌性.

表5 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對供試菌的抑菌作用1)Table 5 Antibacterial activities of the secondary metabolites from endophytic fungi

1)-:沒有抑菌圈;+:抑菌圈直徑<5 mm;++:5 mm≤抑菌圈直徑<10 mm;+++:抑菌圈直徑≥10 mm.

A:金黃色葡萄球菌; B:白色念珠菌.圖2 內(nèi)生真菌PP08和PG11胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌效果Fig.2 Inhibition effects of endophytes PP08 and PG11 on Staphylococcus aureus and candida albicans

2.4 顯色試驗(yàn)結(jié)果

青錢柳內(nèi)生真菌部分菌株培養(yǎng)液經(jīng)細(xì)胞破碎，離心并濃縮上清液，得到供試發(fā)酵液，進(jìn)行顯色反應(yīng).由表6可以推論，顯色反應(yīng)中，下述7株菌株(PP03、PY01、PG11、PZ06、PY12、PP12、PP06)具有產(chǎn)生黃酮類化合物的能力.

表6 青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵液顯色反應(yīng)Table 6 Color reaction of the fermented liquids

2.5 薄層層析試驗(yàn)結(jié)果

對青錢柳內(nèi)生真菌濃縮液以不同的層析條件進(jìn)行多次薄層層析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8號層析液(甲苯∶甲酸甲酯∶甲酸=5∶4∶1)和18號層析液(正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2)可將黃酮對照品分為幾個(gè)遷移率明顯不同的斑點(diǎn)，其余10多種展開劑層析時(shí)均出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，而在上述2種展開劑中18號層析液層析效果最穩(wěn)定，故認(rèn)為正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2最適合青錢柳內(nèi)生真菌黃酮的TLC分離.

選用上述展開劑對青錢柳內(nèi)生真菌培養(yǎng)液的濃縮液進(jìn)行展開，發(fā)現(xiàn)該層析條件下培養(yǎng)液能夠得到很好的分離.用3% AlC13乙醇溶液噴霧顯色后，用GDS-760圖象及分析系統(tǒng)(UVP)經(jīng)紫外檢測成像，結(jié)果如圖3所示.

樣品PP06(S1)和樣品PP03(S2)都只產(chǎn)生了一個(gè)層析斑點(diǎn)，其遷移率與異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(M1)的相同，推測為同種成分；樣品PY12(S3)產(chǎn)生2個(gè)斑點(diǎn)，斑點(diǎn)1對應(yīng)異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(M1)，斑點(diǎn)2對應(yīng)山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(M3)，由于槲皮素(M2)和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率極為相近，也對應(yīng)青錢柳黃酮提取物中的相同的斑點(diǎn)，可確定該種活性物質(zhì)為青錢柳黃酮中的一種，但其具體種類僅通過遷移率并不能完全確定，有待于高效液相色譜的進(jìn)一步檢測；樣品PZ06((S4)的薄層層析出現(xiàn)4個(gè)顯色斑點(diǎn)，但斑點(diǎn)1不太明顯，可能是由于其含量過低，導(dǎo)致顯色反應(yīng)不明顯，其它3個(gè)斑點(diǎn)中，斑點(diǎn)3和斑點(diǎn)4分別對應(yīng)異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，而斑點(diǎn)2和青錢柳黃酮的提取物有相對應(yīng)的點(diǎn)，推測其為青錢柳黃酮中的一種，但和上述3種標(biāo)準(zhǔn)品不同.

薄層層析試驗(yàn)結(jié)果表明青錢柳生真菌產(chǎn)生的黃酮類物質(zhì)中有與青錢柳黃酮相同或相似的成分，且進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，均能出現(xiàn)同樣的結(jié)果，這表明青錢柳內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮的能力具有很好的穩(wěn)定性.

M：青錢柳葉黃酮提取物；M1：異槲皮苷；M2：槲皮素；M3：山奈酚；S1：PP06；S2：PP03；S3：PY12；S4：PZ06.圖3 青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵液的薄層層析圖譜Fig.3 Thin layer chromatograph of the organic extractants from the endophytic fungi of Cyclocaryapaliurus

3 討論

本試驗(yàn)從青錢柳不同組織共分離得到67株內(nèi)生真菌，其種群差異明顯，各組織中的優(yōu)勢種群各不相同，通過菌落形態(tài)和顯微形態(tài)對分離得到的青錢柳內(nèi)生真菌進(jìn)行分類鑒定，分別隸屬于3綱4目6科10屬，青錢柳中的枝、皮、葉、根不同部位分離出的內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量不盡相同.植物內(nèi)生真菌的分布不僅受宿主植物影響，還受外界環(huán)境的影響.即使同一種植物，不同組織中內(nèi)生真菌的數(shù)量和種類也不盡相同，存在復(fù)雜的多樣性[34-35].Rosenblueth et al[36]認(rèn)為內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)的分布通常下部組織多于上部組織，越往植株頂部，內(nèi)生真菌越少.目前對植物可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的分離結(jié)果表明，內(nèi)生真菌在林木組織中以根部最多，枝次之，葉部較少，而在一年生和多年生的經(jīng)濟(jì)作物中，根部最多，葉枝中數(shù)量相近[37].本研究表明青錢柳根部的內(nèi)生真菌密度大、數(shù)量多，皮次之，枝和葉中內(nèi)生真菌的數(shù)量最少，與已有的研究結(jié)果基本一致[37].青錢柳不同組織共有的種群相對較多，表明內(nèi)生真菌在植物的不同部位、不同組織中分布廣泛；而其各自的特有種群在種類上也較為豐富，顯示出內(nèi)生真菌在植物中的分布有一定的組織專一性.同種植物不同部位內(nèi)生真菌分布差異的原因，可能是不同部位的微環(huán)境如通氣狀況、酶和其它化學(xué)成分不同適合不同的內(nèi)生真菌類群侵入、生長.并且，本試驗(yàn)的青錢柳從江蘇省鎮(zhèn)江取樣，不同地區(qū)的青錢柳植物體內(nèi)的活性物質(zhì)及內(nèi)生真菌有一定的相似性，但是也有地域差異[38].目前普遍認(rèn)為土壤是內(nèi)生真菌的主要來源，因而地下部位內(nèi)生真菌的數(shù)量多于地上部位.

從不同培養(yǎng)基分離的菌株可以看出，馬丁氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株種類少、數(shù)量多，而察氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株種類較多、菌株較少，體現(xiàn)出不同培養(yǎng)基的特性不同.可以推斷，植物內(nèi)生真菌的數(shù)量與種類與植物自身狀況及所處的環(huán)境密切相關(guān).但是影響內(nèi)生真菌分離結(jié)果的因素較多，首先很難將植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌全部分離出來，這主要是因?yàn)槿斯づ囵B(yǎng)基不可能完全模擬植物體內(nèi)環(huán)境.其次，即使用不同的培養(yǎng)基來分離植物組織的內(nèi)生真菌，也不能保證所有生活在植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌全部被分離出來，因?yàn)橛械膬?nèi)生真菌不能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)[39].

青錢柳內(nèi)生真菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果共得到13株具有抑菌作用的內(nèi)生真菌，其中有2株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物對供試菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，分別屬于青霉屬和鏈格孢屬.結(jié)果表明，不同菌株的抑菌活性存在很大差別.研究表明，內(nèi)生真菌在與植物協(xié)同進(jìn)化過程中，不但自身能夠產(chǎn)生特殊的化學(xué)物質(zhì)，還能誘導(dǎo)宿主植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，作為藥食兩用經(jīng)濟(jì)植物，青錢柳所具有的藥用價(jià)值是否與其體內(nèi)的內(nèi)生真菌有關(guān)，這些內(nèi)生真菌是通過何種途徑作用于宿主植物的，其代謝產(chǎn)物化學(xué)成分的明確以及功能性內(nèi)生真菌的產(chǎn)物等問題，有待于進(jìn)一步研究[40].

本研究在青錢柳內(nèi)生真菌中篩選出7株菌株(PP03、PY01、PG11、PZ06、PY12、PP12、PP06)具有穩(wěn)定的產(chǎn)生黃酮類化合物的能力.目前，已報(bào)道的可產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌有刺盤孢屬[41]、青霉屬[42]、曲霉屬和莖點(diǎn)霉屬[43]等，但就產(chǎn)黃酮的7株菌株的進(jìn)一步鑒定的工作正在開展中以期后續(xù)發(fā)表.同時(shí)，由于槲皮素和山奈酚的遷移率相似，因此還需采用高效液相色譜進(jìn)一步確定其成分.青錢柳黃酮類物質(zhì)主要從青錢柳葉中提取，對珍貴的青錢柳資源消耗較大.如果能利用內(nèi)生真菌，實(shí)現(xiàn)青錢柳黃酮的微生物體外發(fā)酵，則可使青錢柳黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)不受植物資源的限制，并可防止資源的日益短缺.