呂明其, 閔思明, 衣偉萌, 陳楊超, 甘思言, 喬 石, 黃一帆, 馬玉芳

[1.中西獸醫(yī)結合與動物保健福建省高等學校重點實驗室；2.福建省獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室(福建農林大學)，福建 福州 350002]

牛至(Origanumvulgare)又名止痢草，為唇形科(Lamiaceas)牛至屬(Origanum)多年生草本植物或半灌木.牛至味辛、性涼、無毒，具有清熱解表、理氣化濕、利尿消腫之功效，曾收載于《中華人民共和國藥典》(1977年版)[1].牛至香酚是從牛至中提取的一種特殊芳香氣味的揮發(fā)性植物精油，主要成分包括百里香酚、香荊芹酚、γ-萜品烯、p-異丙甲苯等酚類化合物.研究表明，牛至香酚具有促生長[2]、增強免疫力[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]等功效.

本課題組前期研究表明，牛至香酚能促進斷奶仔豬的生長性能，提高機體免疫功能[6-7].脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌膜結構物質，通過靶細胞上的Toll樣受體的信號轉導作用將單核、巨噬細胞漿內核轉錄因子κB激活，使機體中的炎性介質大量釋放造成機體損傷.研究表明，LPS是能引發(fā)免疫造成機體損傷的主要物質，大鼠腹腔注射LPS能夠造成脾臟組織急性損傷或嚴重感染[8].牛至香酚對免疫應激小鼠脾臟細胞因子mRNA表達的影響鮮見報道.本試驗擬研究牛至香酚對免疫應激小鼠脾臟細胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-1β)、NF-κB及核轉錄因子(T-bet、GATA-3)mRNA表達的影響，旨在從分子水平上探討牛至香酚對免疫應激小鼠的免疫調節(jié)機理，豐富牛至香酚免疫藥理學研究內容，為其進一步的開發(fā)應用提供數(shù)據(jù)借鑒.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 80只健康雄性清潔級KM小鼠體重(22±2) g，購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心.

1.1.2 試劑 牛至香酚(百里香酚、香芹酚的含量為67%)由福建中農牧生物藥業(yè)有限公司惠贈；注射用LPS購自Sigma公司；RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司.

1.1.3 儀器與設備 主要儀器與設備有獨立送回風凈化籠具(蘇州市蘇杭科技器材有限公司)、電子分析天平[梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司]、SW-CJ-1F型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、ALLEGRA X-22R型冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特公司)、CFX96型實時熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)、SK-1快速混勻器(金壇市科析儀器有限公司).

1.2試驗動物分組與處理

將80只小鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分成5組(空白對照組、模型組及牛至香酚低、中、高劑量組)，每組16只.所有小鼠均自由飲水、采食.牛至香酚低、中、高劑量組分別按25、50、100 mg·kg-1的劑量灌胃牛至香酚，空白對照組、模型組則灌胃相同體積的橄欖油，每日1次，連續(xù)14 d.第15天時牛至香酚試驗組、模型組均按8 mg·kg-1的劑量腹腔注射LPS，空白對照組注射等量的生理鹽水.

1.3 樣品采集與處理

小鼠腹腔注射LPS 6 h后，采用頸椎脫臼法處死.無菌取脾臟組織，裝入經DEPC水處理后的Eppendorf管，置-80 ℃凍存.

1.4 小鼠脾臟細胞因子、核轉錄因子mRNA表達水平的測定

采用qRT-PCR檢測小鼠脾臟細胞因子(IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α)、NF-κB及核轉錄因子(T-bet、GATA-3) mRNA的表達水平.

1.4.1 RNA的提取 將脾臟組織放入1.5 mL去酶管中，于冰上研磨，加入1 mL RNAiso Plus混勻，用離心管分裝兩管，室溫靜置5 min；每個離心管加入200 μL氯仿，振蕩至液體乳化呈乳白色，室溫靜置3 min，于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；上清液轉移至新的離心管中，并加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min；于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，棄RNA沉淀，于4 ℃、7 500 r·min-1離心5 min，棄上清液.室溫下放置干燥，加入20 μL RNase-free水使RNA溶解，測定RNA的濃度和純度[9].

1.4.2 cDNA的合成 反轉錄體系為：2 μL 5×Prime ScriptTM緩沖液、0.5 μL Prime ScriptTMRT Enzyme MixⅠ、0.5 μL 50 μmol·L-1Oligo dT Primer、0.5 μL 10 μmol·L-1Random 6mers、1 μL總RNA、5.5 μL無DNA酶水.反轉錄程序：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃保存.

按照反轉錄試劑盒說明書的步驟將提取的RNA反轉錄成cDNA，按照SYBR Premix EX TaqTM試劑盒說明書的步驟測定細胞因子mRNA的表達量.

表1 引物序列及擴增長度Table 1 Primer sequences and product sizes

1.4.3 qRT-PCR檢測 qRT-PCR反應體系：0.25 μL正向引物、0.25 μL反向引物、6.25 μL SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、1 μL cDNA、4.75 μL dH2O.擴增條件：95 ℃預變性120 s；95 ℃變性5 s，退火至62 ℃，延伸30 s，38個循環(huán)；65 ℃延伸5 s.經過相應條件擴增后，以β-actin為內參基因，每個樣本進行3次重復.引物序列及擴增長度[9-10]如表1所示，由上海生物工程有限公司合成.

1.5 數(shù)據(jù)處理

將每個DNA樣品分別進行RT-PCR檢測，檢測結果采用相對定量法，測得樣品的循環(huán)閾值(Ct)，采用2-△△Ct法計算并分析不同試驗組相關引物的變化情況.△△Ct=[Ctm(待測樣品)-Ctn(待測樣品)]-[Ctm(對照樣品)-Ctn(對照樣品)]，式中，m表示目的基因，n表示內參基因.本試驗以β-actinRNA作為內參基因，其余引物的RNA作為目的基因.試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，并以“平均值±標準差”表示，采用LSD法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著.

2 結果與分析

2.1 牛至香酚對LPS所致的免疫應激小鼠脾臟細胞因子mRNA表達水平的影響

牛至香酚對LPS所致的免疫應激小鼠脾臟細胞因子mRNA表達水平的影響見表2.由表2可知，與空白對照組相比，模型組小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、NF-κBmRNA的表達量極顯著提高(P<0.01).與模型組相比，牛至香酚試驗組致炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6 mRNA的表達量有所下降，且差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)；NF-κBmRNA的表達量降低，其中，牛至香酚高劑量組與模型組的差異顯著(P<0.05).與空白對照組相比，模型組IL-10 mRNA的表達量顯著提高(P<0.05)；與模型組相比，牛至香酚低、高劑量組IL-10 mRNA的表達量有所提高，中劑量組降低；牛至香酚試驗組IL-10 mRNA表達量與空白對照組的差異極顯著(P<0.01).

表2 牛至香酚對小鼠脾臟細胞因子mRNA表達水平的影響1)Table 2 Effect of oregano phenol on cytokine mRNA expression in the spleen of the experimental mice

1)同列數(shù)據(jù)后附不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)，附不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

2.2 牛至香酚對LPS所致的免疫應激小鼠脾臟核轉錄因子mRNA表達水平的影響

牛至香酚對LPS所致的免疫應激小鼠脾臟核轉錄因子mRNA表達水平的影響見表3.由表3可知：與空白對照組相比，模型組小鼠T-betmRNA的表達量極顯著提高(P<0.01)，GATA-3 mRNA的表達量及T-bet/GATA-3比值極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，牛至香酚試驗組T-betmRNA的表達量下降，但差異不顯著(P>0.05).牛至香酚中劑量組GATA-3 mRNA的表達量顯著高于模型組(P<0.05)，低、高劑量組的表達量雖高于模型組，但差異不顯著(P>0.05).與模型組相比，牛至香酚試驗組的T-bet/GATA-3比值有所上升，但差異不顯著(P>0.05).

表3 牛至香酚對小鼠脾臟核轉錄因子mRNA表達水平的影響1)Table 3 Effect of oregano phenol on the mRNA expression of transcription factors in the spleen of the experiment mice

1)同列數(shù)據(jù)后附不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)，附不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

3 討論

LPS作為一種免疫刺激劑，能通過靶細胞上的Toll樣受體的信號轉導作用將單核、巨噬細胞漿內核轉錄因子κB激活，引起免疫應答，從而啟動TNF-α，IL-1、IL-6等炎癥細胞因子的轉錄與表達[11]，而抗炎因子IL-10在抑制巨噬細胞分泌致炎因子的同時還抑制Th1細胞產生免疫調節(jié)性細胞因子，在機體免疫抑制中起重要作用[12].NF-κB是一類具有多項調節(jié)功能的核轉錄因子，TNF-α通過與其受體結合來激活NF-κB，而IL-6的產生需要NF-κB在骨髓細胞中被激活.當組織中的IL-6含量增高時，NF-κB含量也會發(fā)生相應變化[13].脾臟是機體最大的外周免疫器官，含有大量的淋巴細胞、巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心.LPS可以促進相關炎性細胞因子分泌的增加誘發(fā)膿毒血癥導致免疫細胞凋亡[14].

本試驗中，牛至香酚試驗組脾臟致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達量低于模型組，但IL-10 mRNA的表達量高于模型組，這與惠永崗等[15]的“葡萄糖—胰島素—鉀極化液(GIK)試驗組IL-10水平高于LPS組，IL-1β、TNF-α水平低于LPS組”研究結果相似.本試驗中，模型組NF-κBmRNA的表達量極顯著高于空白對照組，牛至香酚高劑量組較模型組顯著降低，此結果與韓琳等[16]的“黃芪多糖能通過抑制NF-κB緩解LPS造成的損傷”研究結果相似.表明牛至香酚能有效降低LPS引起的IL-1β、IL-6、TNF-α等致炎因子mRNA的表達量，提高IL-10抗炎因子mRNA的表達量，提示牛至香酚能有效減輕LPS引起的炎癥，幫助機體恢復健康.

Th1、Th2細胞的分化平衡是機體免疫應答調節(jié)的重要環(huán)節(jié)，與疾病發(fā)生、發(fā)展和轉歸的關系密切.T-bet、GATA-3是調節(jié)Th細胞特異性分化的核轉錄因子，分別調控Th細胞向Th1、Th2細胞轉化，影響細胞因子在體內的轉換[17-18].Th1細胞分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子，主要參與細胞免疫應答；Th2細胞主要分泌IL-6、IL-10等細胞因子，主要參與機體的體液免疫[19].正常情況下，Th1、Th2細胞在機體內處于相對平衡的狀態(tài)，當機體發(fā)生異常功能時，兩者之間的動態(tài)平衡被打破[20].研究表明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者中GATA-3的表達量高于正常人，Th2細胞增多，引發(fā)Th1、Th2細胞分化失衡，造成自身免疫紊亂[21].研究表明：臺灣紫芝多糖能顯著提高Th1轉錄因子T-bet的表達，同時降低Th2轉錄因子GATA-3的表達[22]；不同濃度的金線蓮多糖可顯著降低免疫抑制小鼠脾臟組織中T-bet的表達或顯著增強GATA-3的表達[23].研究還表明，強雞散(主要由黃芪、黨參、白頭翁等組成)具有調節(jié)環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠脾臟核轉錄因子GATA-3、T-bet表達量的作用，通過降低GATA-3的表達量，使Th1、Th2細胞的分化平衡向Thl方向轉化[24].

本試驗結果表明，LPS可不同程度地提高小鼠脾臟細胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α的表達，引發(fā)Th1、Th2細胞分化失衡.與模型組相比，牛至香酚試驗組脾臟組織中GATA-3 mRNA的表達量增加，T-betmRNA的表達量減少；牛至香酚試驗組的T-bet/GATA-3比值較模型組提高，提示牛至香酚通過提高T-betmRNA的表達量，降低GATA-3 mRNA的表達量來維持機體Th1、Th2細胞分化的動態(tài)平衡，減少Th0細胞向Th1或Th2細胞發(fā)生漂移，減少LPS造成的免疫應激.綜上所述，牛至香酚可以調節(jié)LPS應激狀態(tài)對應的脾臟相關細胞因子及核轉錄因子mRNA的表達；調節(jié)細胞因子mRNA的轉錄，促進相關細胞因子的分泌，從而維持Th1、Th2細胞分化的動態(tài)平衡，表明牛至香酚能對LPS造成的脾臟免疫損傷有很好的保護作用.這與李鵬等[25]的“由牛至油、肉桂油、百里香油組成的植物精油對于LPS所致的仔豬肝臟刺激有較好的保護作用”研究結果相似.

4 小結

本試驗結果表明，牛至香酚能通過調節(jié)免疫應激小鼠脾臟核轉錄因子mRNA的表達，調節(jié)細胞因子mRNA的轉錄，促進相關細胞因子的分泌，減輕LPS對脾臟造成的免疫應激損傷.