馬 宇，周利曉，劉 意，武 衛(wèi)

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病微血管病變的重要表現(xiàn)，是糖尿病患者致死致殘的主要原因，臨床常表現(xiàn)為視物模糊、視力下降、失明等，是中老年常見(jiàn)的致盲眼病，嚴(yán)重影響全球成千上萬(wàn)人的生活質(zhì)量[1]。流行病學(xué)顯示，在我國(guó)糖尿病病史20a的患者患病率幾乎為100%，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，且臨床無(wú)有效治愈方法，因此尋找DR發(fā)生早期診斷標(biāo)志物并及時(shí)治療是延緩其進(jìn)展的關(guān)鍵所在[2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的小分子非編碼單鏈RNA，其作為調(diào)控細(xì)胞功能的關(guān)鍵因子，參與炎癥的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，大量研究表明諸多疾病患者血液中存在miRNAs的特異性表達(dá)，并與眼底腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。miR93和miR21作為具有炎性作用的多功能分子，其異常表達(dá)參與了糖尿病、冠心病、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等諸多慢性低度炎癥性疾病[3-4]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，miR93和miR21在眼部疾病中異常表達(dá)，對(duì)眼部疾病的早期診斷具有高度特異度和敏感度[5]。但國(guó)內(nèi)關(guān)于miR93和miR21聯(lián)合檢測(cè)在DR患者發(fā)病機(jī)制的參與和調(diào)控作用的報(bào)道較少，因此本研究通過(guò)檢測(cè)DR患者血清中miR93和miR21的表達(dá)變化，探討兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)在DR病變進(jìn)展中的預(yù)測(cè)價(jià)值，為臨床新的治療提供理論依據(jù)。

表1 三組一般資料和生化指標(biāo)比較

指標(biāo)DR進(jìn)展組DR非進(jìn)展組對(duì)照組χ2/F/tP性別(男/女,例)27/1518/1623/221.7360.419年齡(x±s,歲)59.21±8.2360.85±7.4753.12±9.231.0200.364病程(x±s,a)14.37±8.7510.25±4.74-0.5470.585BMI(x±s,kg/m2)22.75±2.5122.36±2.4122.93±2.840.4700.626FPG(x±s,mmol/L)9.25±1.56b,d7.17±0.83b4.76±0.69180.71<0.001HbA1c(x±s,%)7.85±0.69b,d5.89±0.58b4.16±0.41459.15<0.001TC(x±s,mmol/L)4.27±0.854.16±1.044.08±0.840.4800.619TG(x±s,mmol/L)1.51±0.391.48±0.421.47±0.510.0600.940LDL-C(x±s,mmol/L)3.23±0.513.18±0.523.13±0.460.4400.643

注：對(duì)照組：健康體檢者。bP<0.01vs對(duì)照組；dP<0.01vsDR非進(jìn)展組。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取本院2013-06/2014-06收治的2型DR患者(T2DM)76例，其中男45例，女31例，年齡59.41±7.52歲，T2DM病程15.7±9.2a。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合WHO 1999年T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合DR國(guó)際臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)年齡≤80歲；(3)體質(zhì)量指數(shù)(BMI)≤24kg/m2者；(4)入院前無(wú)眼部外傷和手術(shù)史；(5)患者和家屬知情同意并配合治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重肝腎功能不全者；(2)合并急慢性感染、風(fēng)濕結(jié)締組織疾病者；(3)合并其他惡性腫瘤者；(4)合并大血管和微血管病變者；(5)接受新生血管藥物治療及有眼部手術(shù)史者；(6)患者研究中途退出，導(dǎo)致臨床數(shù)據(jù)缺失者。根據(jù)4a隨訪結(jié)果，依據(jù)DR有無(wú)進(jìn)展，將患者分成DR非進(jìn)展組(34例)和DR進(jìn)展組(42例)，另選取45例在我院健康體檢者為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理會(huì)知情批準(zhǔn)及受試者同意。

1.2方法

1.2.1 DR檢測(cè)方法采用免散瞳眼底攝片法(免散瞳眼底照相機(jī))進(jìn)行視野眼底照片。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富未知患者信息的眼科醫(yī)生分別進(jìn)行讀片。根據(jù)DR的國(guó)際臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將DR按照嚴(yán)重程度分為2組：(1)非增殖性DR(NPDR)，包括輕度、中度、重度的NPDR；(2)增殖性DR(PDR)。DR進(jìn)展的定義為由較輕病情向較重病情發(fā)展；非進(jìn)展表示基線和4a隨訪時(shí)患者的DR嚴(yán)重程度無(wú)明顯進(jìn)展。

1.2.2生物指標(biāo)檢測(cè)收集所有研究對(duì)象性別、年齡、BMI等一般資料。生化指標(biāo)檢測(cè)：收集所有患者入院后第2d晨起空腹靜脈血5mL，對(duì)照組研究對(duì)象為體檢時(shí)靜脈血，經(jīng)離心后分離血清，采用免疫比濁法檢測(cè)糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)水平，采用全自動(dòng)生化檢驗(yàn)分析儀檢測(cè)所有研究對(duì)象總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerin，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等血脂水平，采用血糖儀檢測(cè)空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)水平。

組別例數(shù)miR93miR21DR進(jìn)展組421.95±0.38b,d1.98±0.40b,dDR非進(jìn)展組341.10±0.151.20±0.21對(duì)照組451.05±0.111.12±0.19 F18.70711.920P<0.001<0.001

注：對(duì)照組：健康體檢者。bP<0.01vs對(duì)照組；dP<0.01vsDR非進(jìn)展組。

1.2.3 miRNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)采用總RNA提取試劑Trizol從100μL血清中提取總RNA，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)血清中miR93和miR21水平的變化。以U6 snRNA為內(nèi)參基因，采用2-△△ct計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量水平，其中△Ct = Ct目的基因-CtU6。

2結(jié)果

2.1三組一般資料和生化指標(biāo)比較三組研究對(duì)象在年齡、性別、BMI方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組TC、TG、LDL-C等生化指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，DR非進(jìn)展組和DR進(jìn)展組患者HbA1c及FPG水平較對(duì)照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且DR進(jìn)展組明顯高于DR非進(jìn)展組(P<0.01，表1)。

2.2各組血清中miR93和miR21表達(dá)量的變化DR進(jìn)展組患者血清中miR93和miR21水平較DR非進(jìn)展組、對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；DR非進(jìn)展組miR93和miR21水平略高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

2.3影響DR患者病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素COX回歸分析結(jié)果顯示，患者血清miR93和miR21水平是DR進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表3)。

表3 COX回歸分析影響DR患者病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

指標(biāo)危險(xiǎn)比(HR)回歸系數(shù)(B)標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)WaldP95%置信區(qū)間上部下部性別1.210-0.0390.0890.1780.6481.3240.692年齡1.037-0.0500.0391.1400.2591.1780.925BMI1.2400.0810.0511.8790.2161.7530.717FPG1.5981.5970.0602.8170.1023.1750.784HbA1c1.6100.0700.0512.1870.1622.6540.659TC1.7310.0970.0493.2400.0712.7720.750TG0.9140.1040.3166.6260.6971.4370.581LDL-C1.6420.0730.0572.4610.0971.7130.766miR932.7041.31705799.147<0.0014.6252.026miR212.0520.7280.3588.416<0.0013.7141.517

表4 miR93和miR21單獨(dú)與聯(lián)合檢測(cè)對(duì)DR進(jìn)展的預(yù)測(cè)價(jià)值

指標(biāo)特異度(%)敏感性(%)曲線下面積miR9381890.883(0.813～0.950)miR2171900.845(0.769～0.914)miR93+miR2187920.946(0.857～0.993)

圖1miR93和miR21單獨(dú)與聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)DR進(jìn)展的ROC曲線。

2.4 miR93和miR21單獨(dú)與聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估DR預(yù)后的價(jià)值ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR93和miR21聯(lián)合檢測(cè)曲線下面積、特異度與敏感度均高于單獨(dú)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4，圖1)。

3討論

DR是糖代謝異常造成的眼部疾病，在我國(guó)隨著糖尿病發(fā)病率的提高，DR的發(fā)生率與致盲率也呈上升趨勢(shì)，其發(fā)病率是一般人群的25倍，DR可造成黃斑水腫、玻璃體出血，導(dǎo)致患者視力下降、視物變形，嚴(yán)重威脅著患者生存質(zhì)量[7-8]。目前DR發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，諸多學(xué)者認(rèn)為與自然免疫和炎癥損傷密切相關(guān)。

近年來(lái)炎癥反應(yīng)與血管病變間的關(guān)系已成為臨床學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)，miR93和miR21作為炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，在DR病情進(jìn)展中，可能與患者血管內(nèi)皮功能障礙和血管綜合征的發(fā)生有關(guān)[9]。在PDR中，與血管生成和纖維化相關(guān)的幾個(gè)小RNA的表達(dá)顯著較高[10]。miR93和miR21參與糖尿病微血管病變的發(fā)生機(jī)制，國(guó)外有學(xué)者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)[11-12]，在DR大鼠模型中內(nèi)皮細(xì)胞的miR93和miR21表達(dá)顯著高于對(duì)照組，其可進(jìn)一步激活炎癥介質(zhì)通路，促進(jìn)血管炎癥的發(fā)生，其可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與DR的進(jìn)展[13]，有研究顯示，miR93和miR21參與糖尿病微血管病變的發(fā)生發(fā)展，且不同病變程度患者其表達(dá)量不盡相同[14]。血漿中miR-93在DR患者中異常高表達(dá)，并與DR患者的增生膜活力及進(jìn)展相關(guān)[15]，miR93發(fā)揮作用的機(jī)制可能為其靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A，在血管生成及維持毛細(xì)血管完整性方面具有重要意義[16]。又有資料顯示，miR93可通過(guò)抑制整合素β-8的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)其在病變組織血管生成和腫瘤生長(zhǎng)等方面的作用[17]。有研究表明miR-21的表達(dá)與病程、HbA1c、FPG和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)呈正相關(guān)。多元線性回歸分析證實(shí)，病程、HbA1c、FPG和HOMA-IR均是影響血漿miR-21表達(dá)的主要因素[18]，提示miR-21可能參與到糖代謝過(guò)程之中。

本研究結(jié)果顯示，DR進(jìn)展組患者血清中miR93和miR21水平明顯高于DR非進(jìn)展組與對(duì)照組，說(shuō)明血清中miR93和miR21在DR患者中異常高表達(dá)，并與DR進(jìn)展具有明顯相關(guān)性。本研究通過(guò)COX回歸分析結(jié)果顯示，患者血清miR93和miR21水平是影響DR患者病情進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。為明確miR93和miR21對(duì)DR進(jìn)展的預(yù)測(cè)價(jià)值，本研究繪制了ROC曲線，結(jié)果顯示miR93和miR21聯(lián)合檢測(cè)曲線下面積(0.946)、特異度(95%)及敏感度(96%)均高于單獨(dú)檢測(cè)，這提示miR93和miR21聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高對(duì)DR進(jìn)展的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，miR93和miR21在DR進(jìn)展期患者血清中水平異常增高，是影響DR患者病情進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)指標(biāo)，兩者聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高對(duì)DR患者病情的預(yù)測(cè)價(jià)值。