劉玲玲，李冰寧，歐陽杰，武彥文,*

（1.北京市科學(xué)技術(shù)研究院，北京市理化分析測試中心，北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心，北京 100094；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

礦物油是C10～C50的飽和烴（mineral oil saturated hydrocarbons，MOSH）和芳香烴（mineral oil aromatic hydrocarbons，MOAH）的總稱[1]，其中MOSH包括直鏈、支鏈和環(huán)狀烷烴。MOSH有害人體健康。研究表明：人體的肝臟、脾臟和淋巴結(jié)等多個(gè)組織和器官均不同程度含有MOSH，特別容易蓄積C16～C35范圍的MOSH，導(dǎo)致慢性炎癥[2]。近年來，越來越多的研究數(shù)據(jù)顯示：食品中廣泛存在礦物油污染，主要污染來源包括環(huán)境污染[3-4]、原料采收和生產(chǎn)加工過程污染[5-6]以及包裝材料遷移[7-9]等。

礦物油組成復(fù)雜，包含數(shù)以萬計(jì)的化合物，其含量無法以其中一個(gè)或幾個(gè)化合物表示，而是需要測定總量。氫火焰離子化檢測器（hydrogen flame ionization detector，F(xiàn)ID）是分析礦物油的理想檢測器，其等碳響應(yīng)特性規(guī)避了缺乏礦物油標(biāo)準(zhǔn)的問題。由于氣相色譜（gas chromatography，GC）通常與FID聯(lián)用。因此，GC-FID成為常用的礦物油分析方法[10]。然而，作為通用檢測器，F(xiàn)ID的靈敏度低、選擇性差，需要通過前處理凈化與富集目標(biāo)物。離線固相萃取結(jié)合大體積進(jìn)樣GC系統(tǒng)[11-15]是較為常用的方法。隨著儀器聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，高效液相色譜-氣相色譜（high performance liquid chromatography-gas chromatography，HPLC-GC）聯(lián)用也逐漸開始普及[16-20]，其中HPLC的作用是分離純化，通過特殊的接口技術(shù)，HPLC-GC可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)凈化-轉(zhuǎn)移-富集-分析的自動化，簡化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，提高了分析效率，并且避免了實(shí)驗(yàn)過程外來污染的引入[10]。

大米是世界各國的主要食糧，我國約有65%的人口日常主食是大米[21]。然而，近十幾年來礦物油污染大米的事件時(shí)有發(fā)生[1,22]。研究表明：大米中MOSH含量約為1.7～160 mg/kg[12,16,23-26]，主要來源于：1）環(huán)境污染；2）收割過程中的機(jī)械油污染；3）裝袋過程中的軟麻油污染；4）包裝材料中的印刷油墨或回收紙板的遷移污染；5）運(yùn)輸和儲藏過程中的防塵劑污染；6）人為拋光大米導(dǎo)致的礦物油污染等[1]。針對大米的礦物油污染問題，本實(shí)驗(yàn)擬通過HPLC-GC研究稻谷和大米中MOSH的含量情況，建立稻谷和大米中MOSH的定量方法，包括使用氧化鋁去除稻谷提取液中烷烴干擾物，確定HPLC自動純化MOSH的中心切割條件；應(yīng)用HPLC-GC研究我國稻谷和市售大米的礦物油污染特征，分析大米中礦物油的可能污染來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻谷和大米樣品各12 個(gè)（以人工和機(jī)器兩種方式各采收6 個(gè)稻谷樣品，將機(jī)器采收的稻谷樣加工成大米樣品6 個(gè)，隨機(jī)采購市售商品大米樣品6 個(gè)）。

正己烷、二氯甲烷（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；氧化鋁（100～200 目，使用前在高溫爐中400 ℃烘烤60 h，冷卻，置于干燥器備用）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；液體石蠟（paraffin oil，PO）、正四十八烷（n-octatetracontane，C48）、聯(lián)環(huán)己烷（cyclohexyl cyclohexane，Cycy）、膽甾烷（5-α-cholestane，Cho）、1,3,5-三叔丁基苯（1,3,5-tritert-butyl-benzene，TBB）、C7～C40正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

自行搭建HPLC-GC聯(lián)用儀（包括LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)（配備紫外檢測器）、GC-2010 plus氣相色譜儀（配備程序升溫蒸發(fā)（programmed temperature vaporizer，PTV）進(jìn)樣系統(tǒng)、FID和AOC-5000 Plus自動進(jìn)樣器） 日本島津公司；N-EVAP氮?dú)獯蹈蓛x 美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

C48、Cho、TBB混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：3 mg/L；Cycy內(nèi)標(biāo)溶液：300 mg/L；液體石蠟標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：0.5、1.0、5.0、25.0、50.0、100.0 mg/L。

1.3.2 樣品中MOSH的提取

稱取大米樣品10.0 g于50 mL錐形瓶中，加入10 μL 300 mg/L的Cycy內(nèi)標(biāo)溶液，加入正己烷于60 ℃超聲提取2 次（每次10 mL，20 min），吸取上清液；合并2 次提取液，氮吹濃縮至1 mL。為驗(yàn)證提取是否完全，樣品經(jīng)2 次提取后的殘?jiān)谜和榍逑?，再加?0 mL正己烷和10 μL內(nèi)標(biāo)溶液于殘?jiān)校?0 ℃超聲提取80 min，吸取上清液，濃縮后檢測其中MOSH含量，含量低于前2 次提取的4%，則認(rèn)為提取完全，可以確定提取次數(shù)為2 次。

由于稻谷樣品中含有大量的天然正構(gòu)烷烴，干擾后續(xù)MOSH的測定，因而提取液需先用活化的氧化鋁去除正構(gòu)烷烴后再進(jìn)行濃縮。具體操作方法為：將10 g活化氧化鋁裝入玻璃層析柱，以正己烷平衡柱床，然后加入提取液，以10 mL正己烷洗脫，收集洗脫液并濃縮、定容至1 mL，注入HPLC-GC分析。

1.3.3 HPLC-GC分析條件

H P L C條件：S u p e l c o L C-S I液相色譜柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）。流動相：A為正己烷，B為二氯甲烷；梯度洗脫：0～0.1 min，100% A（流速0.3 mL/min）；0.1～9.5 min，70% A（流速0.3 mL/min）；9.5～18.5 min，100% B（反向，流速0.5 mL/min）；18.5～28.5 min，100% A（流速0.5 mL/min）。進(jìn)樣量：100 μL。

采用AOC-5000 Plus將MOSH餾分（2.5～3.1 min）轉(zhuǎn)移至GC的PTV汽化室，MOSH進(jìn)入PTV襯管后，設(shè)置升溫程序除去溶劑，并將目標(biāo)組分導(dǎo)入GC色譜柱中分析。PTV升溫條件：初始溫度35 ℃保持1 min（分流比180∶1），以250 ℃/min升溫至360 ℃（關(guān)閉分流閥2 min，隨后以100∶1開啟分流閥）。

G C分析條件：A g i l e n t D B-5 H T毛細(xì)管柱（15 m×0.25 mm，0.1 μm）；升溫程序：35 ℃保持4 min，以40 ℃/min升溫至370 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣；柱內(nèi)采用恒壓模式，壓力為60 kPa；FID溫度380 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以Cycy為內(nèi)標(biāo)物定量計(jì)算MOSH的含量。MOSH的含量通過計(jì)算譜圖基線與寬峰之間的面積得到，基線取決于樣品空白的GC譜圖；寬峰上方的尖峰為天然烷烴，定量計(jì)算時(shí)扣除[10]。

GC譜圖采集和分析分別采用5D Solution和LabSolutions軟件（日本島津公司）。數(shù)據(jù)以表示，采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，配對t檢驗(yàn)方法進(jìn)行組間差異顯著性比較，P＜0.05，差異顯著，P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然烷烴的去除

植物的角質(zhì)層和表面蠟質(zhì)中含有大量天然烷烴，主要為以C23～C35為主的奇數(shù)碳正構(gòu)烷烴[1]。稻谷沒有去除稻殼、皮層和胚，因而含有大量天然烷烴（圖1A）。MOSH是由大量的、幾乎連續(xù)的直鏈、支鏈烷烴和環(huán)烷烴組成，其GC譜圖呈一個(gè)無法分離且跨越一定碳數(shù)范圍的寬峰，MOSH的含量只能通過對基線與寬峰之間的峰面積積分計(jì)算；而寬峰上面的尖峰為天然烷烴，不能算作污染物，計(jì)算MOSH時(shí)需要扣除。也就是說，如果天然烷烴不干擾MOSH寬峰輪廓勾勒計(jì)算峰面積，則無需去除天然烷烴[27]。然而，稻谷的GC譜圖（圖1A）顯示：以C27、C29、C31和C33為主的天然烷烴含量過多，已經(jīng)嚴(yán)重干擾MOSH譜圖的積分。因此，必須通過前處理去除稻谷中的天然烷烴。

圖1 稻谷MOSH提取液經(jīng)活化氧化鋁凈化前（A）、凈化后（B）的HPLC-GC譜圖Fig. 1 HPLC-GC chromatograms of crude (A) and puri fi ed (B)MOSH extracted from paddy

通常，氧化鋁有選擇性吸附長鏈正構(gòu)烷烴的作用，但吸附能力不強(qiáng)。Fiselier等[5,28]研究表明：20 g活化氧化鋁根據(jù)不同活化溫度可吸附1～2 mg碳數(shù)高于C20的正構(gòu)烷烴；同時(shí)也會吸附少量的異構(gòu)烷烴和環(huán)烷烴，以及1.8～2.3 μg的液體石蠟，由于礦物油分析的復(fù)雜性與特殊性，一般認(rèn)為該吸附量不影響礦物油的檢測。因此，選用400 ℃活化10 g氧化鋁凈化稻谷提取液既可以去除天然烷烴，又不影響目標(biāo)物的測定。

由圖1A可見，正構(gòu)烷烴含量過高，無法找到MOSH的輪廓；圖1B為去除天然烷烴后的GC譜圖。經(jīng)過氧化鋁凈化，天然烷烴的C31～C35部分被完全吸附，大部分C25～C29烷烴被除去；剩余的烷烴已經(jīng)不再干擾MOSH寬峰的輪廓，完全不影響礦物油寬峰面積的積分計(jì)算（圖1中方框部分）。因此，確定以10 g活化氧化鋁去除稻谷提取液中的天然烷烴。

2.2 MOSH的中心切割時(shí)間

HPLC-GC中HPLC用于分離除去樣品基質(zhì)（如油脂），同時(shí)將MOSH和MOAH分離。由于HPLC色譜柱的顆粒小、分離效率高，一般采用硅膠填料即可達(dá)到分離目的[10]。其次，分離后的MOSH流分需要精準(zhǔn)地從HPLC轉(zhuǎn)移至到GC，以完成MOSH的準(zhǔn)確定量。本實(shí)驗(yàn)通過“中心切割”技術(shù)[29]，將HPLC流出的MOSH轉(zhuǎn)移至GC分析，再結(jié)合GC的大體積進(jìn)樣系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)凈化-轉(zhuǎn)移-富集-分析的自動化過程。

采用硅膠柱分離提取（濃縮）液中的礦物油時(shí)，MOSH最先流出，其次是MOAH，最后是樣品基質(zhì)。對于MOSH餾分，根據(jù)體積排阻效應(yīng)，通常高分子質(zhì)量的直鏈烷烴先流出，之后為低分子質(zhì)量的直鏈烷烴和環(huán)烷烴[10,30]。為精準(zhǔn)獲得MOSH餾分，本實(shí)驗(yàn)配制了C48、Cho、TBB混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為MOSH餾分的標(biāo)記物，其中C48為高分子質(zhì)量烷烴標(biāo)記物、Cho為MOSH餾分終止標(biāo)記物、TBB為MOAH餾分開始的標(biāo)記物。精準(zhǔn)切割MOSH餾分要求C48全部保留在MOSH中，不得出現(xiàn)在死體積中；Cho必須全部留在MOSH餾分中，不得出現(xiàn)在MOAH中；而代表MOAH的TBB則不得出現(xiàn)在MOSH餾分中。本實(shí)驗(yàn)通過標(biāo)記物確定MOSH餾分的中心切割時(shí)間為2.5～3.1 min。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 儀器精密度和轉(zhuǎn)移性能

由于MOSH是涵蓋一定沸程范圍（C10～C50）的飽和烴混合物，低沸點(diǎn)物質(zhì)容易在溶劑排除的過程中產(chǎn)生揮發(fā)損失，本實(shí)驗(yàn)通過連續(xù)6 次直接進(jìn)樣分析C7～C40正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/L）評估HPLC-GC的精密度和轉(zhuǎn)移性能。考察C11～C40范圍，每種正構(gòu)烷烴的重復(fù)性以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示，平均值為1.4%，儀器精密度良好。以n-C20峰面積為參照，計(jì)算C11～C40正構(gòu)烷烴相對于C20的響應(yīng)情況，結(jié)果如圖2所示。C11響應(yīng)因子為0.76，C12響應(yīng)因子為0.89，C13～C40相對于C20響應(yīng)因子在0.93～0.98范圍內(nèi)。因?yàn)榈陀贑13的MOSH污染很少發(fā)生[31]，具有毒理學(xué)意義的C16～C35的響應(yīng)因子在0.93～1.0范圍內(nèi)，因此，HPLC-GC的轉(zhuǎn)移性能滿足食品樣品中MOSH的測定。

圖2 C11～C40相對于C20響應(yīng)因子分布Fig. 2 Alkane distribution profile within the range of C11–C40

2.3.2 線性范圍

液體石蠟常用作MOSH的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。將1.3.1節(jié)配制的液體石蠟系列工作溶液，在1.3.3節(jié)條件下分析。以GC譜圖中的寬峰面積與對應(yīng)質(zhì)量濃度繪制曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 891 483X－216 571，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，說明液體石蠟在0.5～100 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 定量限的測定

定量限根據(jù)進(jìn)入FID的MOSH質(zhì)量濃度和體積確定。MOSH是飽和烴類化合物的集合（寬峰），其FID的檢測靈敏度僅是單個(gè)化合物（尖峰）的1%，因此，通常要求進(jìn)入FID的MOSH量至少達(dá)到50 ng才能準(zhǔn)確定量分析[10]。本實(shí)驗(yàn)將10 g稻谷（或大米）的提取液濃縮至1.0 mL，注入HPLC-GC的體積為100 μL，相當(dāng)于1.0 g稻谷（或大米）進(jìn)入FID檢測，因此定量限為0.05 mg/kg。

2.3.4 回收率的測定

考慮到稻谷樣品經(jīng)過了氧化鋁凈化，對分析結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響[11]，為此，本實(shí)驗(yàn)選取一個(gè)稻谷樣品進(jìn)行方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證，即向樣品中添加液體石蠟溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，添加量分別為0.25、0.5、1.0 mg/kg[32]。分析步驟為將提取液先經(jīng)氧化鋁凈化，然后濃縮、注入HPLC-GC分析，平行測定6 次后計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD。表1表明，加標(biāo)回收率為89.1%～91.4%，RSD為4.6%～5.5%，說明該方法的準(zhǔn)確度滿足分析檢測要求。

表1 稻谷樣品的加標(biāo)回收率和RSDTable 1 Recoveries and RSDs for spiked samples

2.4 樣品檢測結(jié)果

表2 稻谷和大米樣品中的MOSH含量Table 2 Contents of MOSH in paddy and rice samples

任意選取江蘇省東南部如東縣的6 塊稻田，以人工和機(jī)器兩種方式采收樣品，隨后將機(jī)器采收的稻谷樣品送至當(dāng)?shù)啬シ患庸こ纱竺讟悠?，并且隨機(jī)采購市售商品大米樣品6 個(gè)，共收集稻谷和大米樣品24 個(gè)，采用HPLC-GC分析樣品的MOSH含量，結(jié)果見表2。本方法測定24 個(gè)稻谷和大米樣品中的MOSH，其含量為0.30～2.30 mg/kg。

2.4.1 比較人工和機(jī)器采收的稻谷樣品污染情況

人工采收的稻谷樣品（A1～A6）中MOSH含量平均值為0.50 mg/kg，污染主要來自于環(huán)境[1]。同一塊田地的水稻經(jīng)機(jī)器采收（B1～B6）則MOSH含量平均上升至0.60 mg/kg，可能是采收時(shí)收割機(jī)使用的潤滑油或燃料油等機(jī)械油污染了稻谷。由表3可知，對同一田地的水稻經(jīng)人工和機(jī)器兩種采收方式所得稻谷的MOSH含量配對后進(jìn)行t檢驗(yàn)，P=0.009 9＜0.01，進(jìn)一步說明了兩種采收方式對稻谷的MOSH含量有顯著差異，機(jī)器收割方式引入了新的污染。

表3 采收方式的配對t檢驗(yàn)Table 3 Paired t- test of the effect of harvesting methods on MOSH content of paddy

2.4.2 機(jī)采稻谷經(jīng)磨坊加工后的污染變化

江蘇省如東縣絕大多數(shù)農(nóng)民都使用當(dāng)?shù)啬シ患庸さ淖约姨锏胤N植的大米，因此將機(jī)器采收的稻谷樣品（B1～B6）直接在當(dāng)?shù)啬シ患庸こ纱竺讟悠罚–1～C6）。如表4所示，機(jī)收稻谷和經(jīng)過磨坊加工后大米的MOSH含量配對后進(jìn)行t檢驗(yàn)，P=0.001 2＜0.01，隨著稻谷脫去谷殼，磨坊大米中MOSH含量顯著降低（約50%）。由此可見，稻谷中有接近一半的礦物油污染存在于谷殼中，脫殼過程可以去除大部分礦物油污染，并且主要是毒性較大的C16～C35MOSH（表2）。

表4 磨坊加工稻谷前后的配對t檢驗(yàn)Table 4 Paired t- test of the effect of mill processing on MOSH content of paddy

2.4.3 比較磨坊大米和市售大米的污染情況

我國市售商品大米樣品（7～12）MOSH的污染水平（平均值1.19 mg/kg）遠(yuǎn)低于德國市場商品大米中MOSH的污染水平（平均值12.1 mg/kg）[24]，卻是農(nóng)村磨坊大米樣品（平均值0.33 mg/kg）的4 倍。磨坊將稻谷加工成大米取樣只經(jīng)過3 次碾米工序，而商品大米生產(chǎn)過程復(fù)雜，碾米工序后還需拋光、色選、包裝等工序，因而推斷后續(xù)的加工及包裝環(huán)節(jié)[25]給大米引入了新的污染。

2 種市售大米的MOSH譜圖（圖3）呈現(xiàn)出不同的碳數(shù)范圍分布和譜圖特征。其中圖3A中MOSH寬峰主要位于低沸點(diǎn)區(qū)域，碳數(shù)范圍以n-C17為中心，是柴油污染的典型特征；圖3B中的大部分MOSH處于中心碳為n-C29的高沸點(diǎn)區(qū)域，通常被認(rèn)為是潤滑油的典型特征[3]。需要注意的是，這兩種污染油的污染程度不同，圖3A的柴油污染量為0.35 mg/kg，圖3B的潤滑油污染為1.81 mg/kg。由此可見，市售大米的礦物油污染很可能是在碾米之后的拋光、色選、包裝等加工環(huán)節(jié)，受到柴油和潤滑油遷移污染。

圖3 市售大米中MOSH的HPLC-GC譜圖Fig. 3 HPLC-GC chromatograms of MOSH contamination in commercial rice samples

3 結(jié) 論

本研究建立了HPLC-GC測定稻谷和大米中MOSH的方法，包括確定氧化鋁去除天然烷烴干擾的條件，應(yīng)用中心切割技術(shù)精準(zhǔn)分離得到MOSH餾分，優(yōu)化了大體積進(jìn)樣條件與GC分析條件，最終實(shí)現(xiàn)了樣品前處理與分析過程的自動化。該方法通過精密度、線性范圍、回收率等方法學(xué)考察，可以用于大米等谷物樣品的日常檢測。此外，本實(shí)驗(yàn)通過比較分析稻谷和大米樣品的MOSH含量及其GC譜圖特征，推測大米的礦物油污染來源可能來自大米商品化的拋光、色選、包裝等加工環(huán)節(jié)引入的柴油和潤滑油污染，建議加強(qiáng)產(chǎn)業(yè)鏈監(jiān)管，保證大米質(zhì)量安全。