王淑慧，曹學(xué)麗*，宋沙沙，龍立梅

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京市食品風味化學(xué)重點實驗室，北京 100048）

標準樣品是具有足夠均勻的一種或多種化學(xué)的、物理的、生物學(xué)的、工程技術(shù)的或感官的等性能特征，經(jīng)技術(shù)鑒定，并附有說明有關(guān)性能數(shù)據(jù)證書的一批樣品。是以其性質(zhì)與供試樣品進行比較的質(zhì)量均一的實物樣品。標準樣品是保證文字標準有效實施的實物標準，是文字標準的必要補充，是標準工作一個不可分割的組成部分。

目前，我國的茶葉實物標準較少，已研制的標準茶樣有西湖龍井茶、黃山毛峰、太平猴魁、武夷巖茶等，均是采用感官審評的方法進行研制。在茶葉生產(chǎn)、銷售、質(zhì)量管理中，主要按照標準中傳統(tǒng)感官審評的方法對茶葉分等定級。而傳統(tǒng)感官審評是通過評茶師的視覺、嗅覺、味覺和觸覺，依據(jù)GB/T 23776—2009《茶葉感官評審方法》[1]中的描述對茶葉的滋味、香氣、色澤、外形、葉底“五因子”按不同權(quán)重評審打分，根據(jù)綜合得分來確定茶葉等級。但是，該方法依賴評茶師的評茶經(jīng)驗，存在主觀性強、標準不統(tǒng)一、無法量化等缺點，茶葉市場質(zhì)量良莠不齊，同等級間質(zhì)量差別較大，嚴重影響了茶葉生產(chǎn)和消費，抑制了產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

信陽毛尖茶作為我國的十大名茶之一，具有悠久的歷史，深受大眾親睞，目前，主要根據(jù)GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》[1]、GB/T 22737—2008《地理標志產(chǎn)品信陽毛尖茶》[2]和DB41/T 335—2004《信陽毛尖茶》[3]中的標準對信陽毛尖茶進行質(zhì)量控制和分等定級。尚無信陽毛尖茶的國家標準和實物標準。

茶葉中的化學(xué)成分是茶葉滋味和品質(zhì)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[4-6]，但是通過對單個成分或幾個成分分析的理化檢測方法很難反映茶葉品質(zhì)的全貌[7]。指紋圖譜技術(shù)主要用于中藥的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制等[8]，科研人員將該方法用于茶葉樣品的品質(zhì)研究，在品種鑒定、產(chǎn)地區(qū)別、質(zhì)量控制等方面進行了有意義的嘗試[9-14]。本實驗室前期分別就茶湯滋味成分高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜、茶湯香氣成分氣相色-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）指紋圖譜以及茶湯湯色光譜指紋圖譜與茶葉的等級相關(guān)性進行了系統(tǒng)研究，首次研究了采用指紋圖譜技術(shù)對茶葉進行分等定級的可行性，并得出了肯定的結(jié)果。作為項目研究內(nèi)容之一，通過建立信陽毛尖茶標準樣品茶湯滋味成分HPLC指紋圖譜，采用合適的指紋圖譜信息處理技術(shù)來對茶葉進行分等定級，并完成了3 個不同等級信陽毛尖茶標準樣品的研制。這是國內(nèi)首個具有量化分級特征的茶葉標準樣品。本實驗就該茶葉指紋圖譜分級標準樣品的研制技術(shù)和方法進行總結(jié)報道，為相關(guān)標準樣品的研制提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

信陽毛尖茶：2015年明前、明后、雨前、雨后采至信陽地區(qū)土門、白龍?zhí)兜鹊氐拇翰枧渲朴幸欢▍^(qū)別度的3 個級別的茶樣各一定量，其中一級主要為清明前后茶、二級樣品為雨前茶、三級樣品為雨后春茶，級別越高，采茶時間越早。用復(fù)合鋁箔袋密封樣品，保存于4 ℃冰箱中，冷藏待用。

乙腈（色譜級） 美國Fisher科學(xué)公司；磷酸（色譜級） 天津光復(fù)精細化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 HPLC儀（配有四元梯度泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器、Chem Station色譜工作站等） 美國Agilent公司；Atlantis T3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）美國Waters公司；QP 2010 Plus GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；手動固相微萃取進樣器、57328-U 50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國Supelco公司；150 mL專業(yè)茶葉評審杯景德鎮(zhèn)陶瓷廠。

1.3 方法

1.3.1 茶湯滋味指紋圖譜建立

茶湯的制備按照GB/T 23776—2009《茶葉感官評審方法》[1]沖泡綠茶的程序進行，稱量3 g綠茶樣品于150 mL評查杯中，倒入150 mL沸水，蓋上杯蓋沖泡5 min后，將茶湯濾出，待茶湯的溫度降低后，取一定量的茶湯過0.22 μm濾膜，進行HPLC分析。

根據(jù)本實驗室的前期研究，采用如下條件建立HPLC指紋圖譜[15]。分析條件：Waters Atlantis T3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.04%磷酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～60 min，4%～25%B；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；檢測波長210 nm。每份信陽毛尖茶樣品均做3 次平行實驗。將所獲得的同一等級的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版本），生成相應(yīng)等級茶葉的HPLC對應(yīng)指紋圖譜。

1.3.2 香氣GC-MS指紋圖譜建立

參照GB/T 23776—2009《茶葉感官評審方法》[1]沖泡綠茶的程序，準確稱取茶葉樣品3.0 g，放入200 mL的三角瓶內(nèi)，倒入150 mL沸水，用錫箔紙封口，室溫下靜置5 min，待茶葉香氣充分揮發(fā)和平衡。首先將其置于80 ℃恒溫水浴鍋中，同時將已經(jīng)老化15 min的萃取頭插入三角瓶內(nèi)茶湯的上方，將SPME的手柄固定好，推出萃取頭并開始計時，頂空吸附60 min后取出，立即插入GC儀進樣口，在250 ℃條件下熱脫附5 min，進行GC-MS檢測[16]。每份信陽毛尖茶樣品均做3 次平行實驗。將所獲得的同一等級的GC-MS總離子流圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版本），生成相應(yīng)等級茶葉的GC-MS對應(yīng)指紋圖譜。

GC-MS分析條件：Rxi-5 MS彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持3 min，以4 ℃/min速率升到80 ℃，保持2 min，再以2 ℃/min速率升到160 ℃，不保持，最后以12 ℃/min速率升到250 ℃，保持3 min，升溫程序結(jié)束；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純He氣（純度99.999%）；柱流量1.0 mL/min；采用不分流進樣方式。電子電離源；離子源溫度200 ℃；離子化電壓70 eV；質(zhì)量掃描范圍35～450 u；檢測器電壓1.00 kV。

1.3.3 指紋圖譜相似度計算

色譜指紋圖譜的建立包括兩方面的內(nèi)容：色譜指紋圖譜的獲得和色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)的處理，而選擇合適的色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)處理方法是指紋圖譜技術(shù)的重點和難點。同種綠茶的分等定級屬于小類水平上的區(qū)別，所以選擇適合同種綠茶不同等級的相似度計算方法是體現(xiàn)差異的關(guān)鍵[17-25]。根據(jù)本實驗室前期研究，發(fā)現(xiàn)新改良程度相似度法能最大程度地反映同種綠茶不同等級之間的差異。因此，本實驗選擇新改良程度相似度法進行等級之間指紋圖譜相似度計算，按下式計算新改良程度相似度[24]：

式中：ai為系統(tǒng)A中第i個共有特征要素的值；bi為系統(tǒng)B中第i個共有特征要素的值；在此代表兩指紋圖譜中同一特征成分的相對峰面積；n為系統(tǒng)中共有特征要素的個數(shù)。

1.3.4 茶葉標準樣品的研制

參考標準樣品工作導(dǎo)則進行[26-28]，具體技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 信陽毛尖茶3 個級別標準樣品研制技術(shù)路線Fig. 1 Flow chart for the development of Xinyang Maojian tea CRMs

1.3.4.1 樣源企業(yè)遴選

信陽毛尖茶實物標準樣品制作的首要環(huán)節(jié)是茶葉原料的選取。樣品采集時要充分考慮樣源企業(yè)的遴選、樣品的覆蓋范圍、樣品質(zhì)量的控制、樣品產(chǎn)地的價值比重等因素，以保證樣品的代表性和針對性。綜合考慮眾多信陽毛尖茶葉公司情況，茶園分布地理位置及其品牌知名度和市場評價，最終將信陽文新茶葉有限公司作為本次標準樣品研制的樣源企業(yè)。

1.3.4.2 樣品采集與制作

樣源企業(yè)確定后，茶葉實物標準制作時采集的樣品通常有2 種方式，一種是單樣采集，即由樣源企業(yè)根據(jù)標準樣品制作要求，采集某一產(chǎn)地的樣品，進行制樣；另一種是混樣采集，即由樣源企業(yè)根據(jù)要求采集所覆蓋區(qū)域內(nèi)的樣品并將覆蓋區(qū)域內(nèi)的樣品拼成混樣，用于制樣。

為提高標準樣品的代表性及其實用性，樣品采用混樣采集。基于本實驗室前期的大量研究，已經(jīng)對各級別的品質(zhì)情況和差異程度有了全面和深入的把握，要求樣源企業(yè)在樣品采集時，對茶葉級別有針對性的進行采集；在干凈、衛(wèi)生的環(huán)境中加工成成品茶葉；并在獨立、干凈、干燥的環(huán)境中拼配成一級、二級、三級共3 個級別樣品。本次樣源采集時同時覆蓋了2015年明前、明后、雨前、雨后等春茶采摘時期，及土門、白龍?zhí)?、黑龍?zhí)兜榷嗟氐拇翰铇悠?。其中，一級主要為清明前后茶、二級樣品均為雨前茶、三級樣品為雨后春茶。具體采樣信息如表1所示。

表1 茶樣采集信息Table 1 Information about tea samples tested in this study

1.3.4.3 分裝與貯存

茶葉樣品采用復(fù)合鋁箔袋密封包裝。分裝在相對獨立和潔凈的空間進行，以每袋50 g分裝，其中，一級20 個（共1 050 g）、二級40 個（共2 050 g）、三級60 個（共3 150 g），分別以I-1～I-20、II-1～II-40和III-1～III-60進行命名。分裝好的各級樣品再用干凈的塑料袋分別包裝，放在－18 ℃的冰箱中長期保存。

1.3.4.4 均勻性檢驗

以茶湯滋味成分HPLC指紋圖譜相似度作為評價依據(jù)，根據(jù)GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導(dǎo)則（3）標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》[28]中7均勻性研究的要求進行。具體方法：采用隨機順序重復(fù)測量的方法，從3 個等級分裝后的茶樣中分別隨機抽取10 袋樣品各級分別按3 種程序從每袋中稱取3 g樣品3 份，按1.3.1節(jié)方法，每份樣品分別制備茶湯，每份茶湯樣品測定3 次，進行HPLC指紋圖譜分析，3 次進樣順序為第1次：1、3、5、7、9、2、4、6、8、10；第2次：10、9、8、7、6、5、4、3、2、1；第3次：2、4、6、8、10、1、3、5、7、9。以一級標準樣品平均對照指紋圖譜為參照，以每份茶湯樣品的15 個特征滋味成分的3 次測量平均峰面積百分比為原始數(shù)據(jù)，進行相似度計算。通過方差分析和F檢驗評價各級標準樣品的均勻性。

1.3.4.5 穩(wěn)定性檢驗

以茶湯滋味成分HPLC指紋圖譜相似度作為評價依據(jù)，根據(jù)GB/T 15000.3—2008[28]中8穩(wěn)定性研究的要求進行。具體方法：本研究以半年為期，對制備的信陽毛尖一級、二級、三級標準樣品進行穩(wěn)定性檢驗。從每級樣品中隨機抽取一袋，每個時間節(jié)點均準確稱量3 份，每份3 g，按1.3.1節(jié)方法進行HPLC指紋圖譜分析，每份茶湯以連續(xù)測定2 次的平均值進行計算。以一級標準樣品第1天檢測的平均指紋圖譜為參照，以每份樣品2 次測量的15 個特征滋味成分平均峰面積百分比為原始數(shù)據(jù)，進行相似度計算。采用t檢驗評價各級標準樣品的穩(wěn)定性。

1.3.4.6 定值

以茶湯滋味成分HPLC指紋圖譜相似度作為評價依據(jù)，根據(jù)GB/T 15000.3—2008[28]中9特性值測定的要求進行，采用多個實驗室協(xié)作研究。本標準樣品參加定值的實驗室為8 個。每個定值實驗室各級抽取3 袋樣品，每袋準確稱取2 份茶樣，每份3 g，按1.3.1節(jié)方法進行HPLC指紋圖譜分析，每份茶湯連續(xù)進樣2 次。以所有定值實驗室一級標準樣品的總平均指紋圖譜為參照，每份茶樣2 次測量的15 個特征滋味成分平均峰面積百分比為原始數(shù)據(jù)，計算各定值實驗室各級各份樣品的指紋圖譜相似度，進行相似度定值。

1.3.5 與香氣成分GC-MS指紋圖譜比對

根據(jù)本實驗室前期對綠茶茶湯香氣成分GC-MS指紋圖譜的研究，建立一級、二級、三級標準樣品的香氣成分GC-MS指紋圖譜并計算相似度，與滋味成分HPLC指紋圖譜相似度結(jié)果進行對比。

1.3.6 與專家感官評審結(jié)果比對

根據(jù)GB/T 23776—2009[1]和GB/T 22737—2008[2]相關(guān)標準和規(guī)定對所研制樣品進行感官評價，以與滋味成分HPLC指紋圖譜分級結(jié)果進行對比。共聘請5 名具有資質(zhì)的高級評茶師進行，并對檢驗場所、環(huán)境條件、儀器、用具等進行檢查，各評審專家均獨立完成對待測標準樣品的盲樣感官審評，評語引用GB/T 14487—2017《茶葉感官審評術(shù)語》。

2 結(jié)果與分析

2.1 滋味成分HPLC指紋圖譜的建立及方法學(xué)考察結(jié)果

在前期對茶湯滋味成分HPLC指紋圖譜與等級相關(guān)性研究中，對包括色譜柱、流動相、檢測波長及柱溫、流速等在內(nèi)的分析條件進行篩選和優(yōu)化，并對方法的穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性進行了考察[15]。如圖2所示，通過與標準樣品保留時間比對和HPLC-高分辨質(zhì)譜相結(jié)合的方式，確定信陽毛尖茶湯的15 種共有特征滋味成分[15]。這15 種物質(zhì)不僅對茶湯風味的鮮（L-茶氨酸）、甜（糖類：沒食子酰葡萄糖、三沒食子酰葡萄糖）、有機酸（酸類：沒食子酸）、澀和苦（兒茶素類）、苦（咖啡堿、可可堿）等有重要貢獻，而且具有廣泛的生理活性作用，在人類感官的感受下，綜合反映，形成綠茶鮮醇柔和的滋味品質(zhì)。

圖2 標準樣品HPLC圖和3 個等級信陽毛尖茶的指紋圖譜Fig. 2 HPLC fi ngerprints of three grades of Xinyang Maojian tea

2.2 均勻性檢驗結(jié)果

均勻性是標準樣品最基本的屬性。對具有一定規(guī)格的樣品，不論此標準樣品是否取自同一包裝（如瓶、包），通過檢驗，其被測定特性值都落在規(guī)定不確定度范圍內(nèi)，就該標準樣品的這一特性而言稱為均勻。

2.2.1 一級茶樣的均勻性

一級標準樣品的均勻性檢驗數(shù)據(jù)及方差分析結(jié)果如表2和表3所示。F檢驗表明，一級標準樣品是均勻的。

表2 一級標準樣品均勻性檢驗的指紋圖譜相似度Table 2 Homogeneity of grade I samples based on fi ngerprint similarities

表3 一級標準樣品均勻性檢驗的指紋圖譜相似度方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for homogeneity of grade I samples based on fi ngerprint similarities

2.2.2 二級茶樣的均勻性

二級標準樣品的均勻性檢驗數(shù)據(jù)及方差分析結(jié)果如表4和表5所示。F檢驗表明，二級標準樣品是均勻的。

表4 二級標準樣品均勻性檢驗的指紋圖譜相似度Table 4 Homogeneity of grade II samples based on fi ngerprint similarities

表5 二級標準樣品均勻性檢驗的指紋圖譜相似度方差分析Table 5 ANOVA for homogeneity of grade II samples based on fi ngerprint similarities

2.2.3 三級茶樣的均勻性

三級標準樣品的均勻性檢驗數(shù)據(jù)及方差分析結(jié)果如表6和表7所示。F檢驗表明，三級標準樣品是均勻性的。

表6 三級標準樣品均勻性檢驗的指紋圖譜相似度Table 6 Homogeneity of grade III samples based on fi ngerprint similarities

表7 三級標準樣品均勻性檢驗的指紋圖譜相似度方差分析Table 7 ANOVA for homogeneity of grade III samples based on fi ngerprint similarities

以上均勻性檢驗結(jié)果表明，以3 g為最小取樣量時，所制備的三級信陽毛尖茶標準樣品都是均勻的。但是從方差分析的結(jié)果可以看出，一級均勻性最好，三級均勻性最差。這與茶葉本身的品質(zhì)有關(guān)。

2.3 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

2.3.1 一級茶樣的穩(wěn)定性

表8 一級、二級、三級標準樣品穩(wěn)定性檢驗的指紋圖譜相似度計算結(jié)果匯總Table 8 Stability of grades I, II and III samples based on fi ngerprint similarities

標準樣品在規(guī)定的條件下貯存，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，其描述的性能數(shù)值應(yīng)保持在規(guī)定的限量范圍內(nèi)，如表8所示。一級茶樣每次計算的相似度平均值在測定時間內(nèi)沒有隨時間的變化而明顯的升高或降低。

采用t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析：

信陽毛尖一級標準樣品隨時間變化而均勻發(fā)生變化，采用直線作為經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，觀察斜率值是否有顯著變化對標準樣品的穩(wěn)定性變化進行預(yù)測，為此做如下數(shù)理處理：

所以，斜率的變化不顯著。因而信陽毛尖一級標準樣品在半年內(nèi)未觀測到明顯的不穩(wěn)定性。

有效期t為180 d的長期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻為：

2.3.2 二級茶樣的穩(wěn)定性

如表8所示，每次計算的相似度平均值在測定時間內(nèi)沒有隨時間的變化而明顯的升高或降低。

用t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，分析方法同一級茶樣。

所以，斜率的變化不顯著。因而信陽毛尖一級標準樣品在半年內(nèi)未觀測到明顯的不穩(wěn)定性。

有效期t為180 d的長期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻為：

2.3.3 三級茶樣的穩(wěn)定性

如表8所示，每次計算的相似度平均值在測定時間內(nèi)沒有隨時間的變化而明顯的升高或降低。

用t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，分析方法同一級茶樣。

所以，斜率的變化不顯著。因而信陽毛尖一級標準樣品在半年內(nèi)未觀測到明顯的不穩(wěn)定性。

有效期t為180 d的長期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻為：

由以上穩(wěn)定性檢驗的結(jié)果可以看出，所制備的茶葉標準樣品在－18 ℃貯存半年內(nèi)穩(wěn)定，更長時間的穩(wěn)定性還需進一步跟蹤。根據(jù)感官評審茶葉標準樣品的研制先例，一般認為茶葉標準樣品在－18 ℃貯存3 a是穩(wěn)定的。

2.4 定值

定值是指采用技術(shù)上有效的方法，確定樣品的一個或多個特征值的程序。本標準樣品按照GB/T 15000.3—2008標準要求，采用多個實驗室協(xié)作實驗定值，參加定值的實驗室共8 個。3 個級別的茶樣定值結(jié)果如表9～11所示。

2.4.1 一級茶樣的定值結(jié)果

對所測定結(jié)果，采用格拉布斯（Grubbs）檢驗法進行檢驗，未發(fā)現(xiàn)異常值。從以上對檢驗數(shù)據(jù)的考察，所得數(shù)據(jù)符合GB/T 15000.3—2008統(tǒng)計計算要求。

表9結(jié)果的總平均值可按下式計算：

實驗室內(nèi)重復(fù)性標準偏差：

實驗室間再現(xiàn)性標準偏差按下式計算：

總平均值的不確定度：

M間、M內(nèi)的計算方法參照均勻性檢驗中的說明。

2.4.2 二級茶樣的定值結(jié)果

表10 二級標準樣品滋味成分HPLC指紋圖譜相似度定值結(jié)果匯總Table 10 Certification of grade II samples based on fi ngerprint similarities

對所采集的測定結(jié)果，采用格拉布斯（Grubbs）檢驗法進行檢驗，未發(fā)現(xiàn)異常值。從以上對檢驗數(shù)據(jù)的考察，所得數(shù)據(jù)符合GB/T 15000.3—2008統(tǒng)計計算要求。與一級茶樣的計算方法相同，得：

2.4.3 三級茶樣的定值結(jié)果

表11 三級標準樣品滋味成分HPLC指紋圖譜相似度定值結(jié)果匯總表Table 11 Certification of grade III samples based on fi ngerprint similarities

對所采集的測定結(jié)果，采用格拉布斯（Grubbs）檢驗法進行檢驗，未發(fā)現(xiàn)異常值。從以上對檢驗數(shù)據(jù)的考察，所得數(shù)據(jù)符合GB/T 15000.3—2008統(tǒng)計計算要求。與一級茶樣的計算方法相同，得：

2.4.4 定值結(jié)果匯總

根據(jù)GB/T 15000.3—2008標準規(guī)定，定值結(jié)果由標準值和不確定度組成。依據(jù)HPLC指紋圖譜法，經(jīng)相似度法計算指紋圖譜間的相似度所得全部計算結(jié)果，計算出標準樣品的相似度標準值。標準樣品特性標準值的擴展不確定度由標準值定值實驗的不確定度、均勻性檢驗的不確定度Ubb和穩(wěn)定性檢驗的不確定度Ults組成。計算公式為：（置信度95%，k=2）。信陽毛尖茶一級、二級、三級標準樣品滋味成分HPLC指紋圖譜的相似度定值結(jié)果如表12所示。

表12 信陽毛尖茶標準樣品滋味成分HPLC指紋圖譜相似度定值結(jié)果Table 12 Certified values of grades I, II and III samples based on fi ngerprint similarities

2.5 與香氣成分GC-MS指紋圖譜比對

在茶葉品質(zhì)感官審品中，同時對茶葉的滋味、香氣、外形、湯色、葉底“五因子”進行評審，只是各因子所占權(quán)重比例不同。本實驗室前期分別就茶湯滋味成分HPLC指紋圖譜、茶湯香氣成分GC-MS指紋圖譜、以及茶湯湯色光譜指紋圖譜與茶葉的等級相關(guān)性進行了系統(tǒng)研究，表明采用指紋圖譜技術(shù)對茶葉進行分等定級的可行性。

在本標準樣品研制中，僅以信陽毛尖茶的茶湯滋味成分HPLC指紋圖譜的相似度作為評價指標。為驗證僅采用單一指紋圖譜研制信陽毛尖茶標準樣品的可靠性，本實驗又對所研制的信陽毛尖一級、二級、三級標準樣品進行了基于茶湯香氣成分的GC-MS指紋圖譜的相似度分析。

2.5.1 GC-MS指紋圖譜

按照前述的分析方法，分別建立信陽毛尖3 個級別標準樣品GC-MS指紋圖譜，如圖3所示，從下到上一次為一級、二級、三級。各等級標準樣品根據(jù)隨機取樣表隨機抽取10 袋，每袋取3 份進行分析。將所獲得的同一等級GC-MS色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版本），生成相應(yīng)等級茶葉的GC-MS指紋圖譜。以22 個主要共有香氣特征峰為參數(shù)，以一級茶樣的平均指紋圖譜作為對照指紋圖譜，進行各級各樣指紋圖譜的相似度計算。

圖3 信陽毛尖茶標準樣品GC-MS指紋圖譜Fig. 3 GC-MS fi ngerprints of three grades of Xinyang Maojian tea

2.5.2 GC-MS指紋圖譜相似度分析

表13 信陽毛尖3 個級別茶樣香氣成分GC-MS指紋圖譜相似度Table 13 Similarity values of three tea grades based on GC-MS fi ngerprint

如表13所示，將上述結(jié)果與表12的HPLC指紋圖譜相似度定值結(jié)果相比較，從相似度數(shù)值來看，一級茶樣的GC-MS指紋圖譜相似度略低，二級和三級樣品GC-MS指紋圖譜與其HPLC指紋圖譜相似度數(shù)值相當。GC-MS指紋圖譜相似度與茶葉等級之間的相關(guān)性很好，沒有出現(xiàn)交叉錯位現(xiàn)象。由于香氣成分的GC-MS指紋圖譜分析步驟較為復(fù)雜，因此沒有同時作為標準樣品研制的評價指標。

2.6 與專家感官評審結(jié)果比對

為與感官評價法進行比較，并對以HPLC指紋圖譜的方法所研制的信陽毛尖茶一級、二級、三級共3 個級別標準樣品用感官審評法進行了鑒定。鑒定小組由5 名具有高級評茶師資質(zhì)的專家組成。從表14可以看出，以HPLC指紋圖譜法所研制的信陽毛尖茶三個等級標準樣品分別與感官審評的信陽毛尖茶一級、二級和三級等對應(yīng)，從另一個角度說明了本標準茶葉樣品研制的科學(xué)性。

表14 信陽毛尖茶標準樣品評分統(tǒng)計Table 14 Sensory evaluation of three tea grades

3 結(jié) 論

本實驗以指紋圖譜的相似度作為評價指標，按照《標準樣品工作導(dǎo)則》的要求，研制了3 個級別的信陽毛尖茶標準樣品。對所研制標準樣品的均勻性、穩(wěn)定性進行檢驗，并采用8 家聯(lián)合定值的方法，對各級茶樣的指紋圖譜相似度進行定值和不確定度的確定。相似度標準值±UCRM定值結(jié)果分別為：0.918±0.027（一級）、0.662±0.033（二級）、0.400±0.074（三級）。并與感官評審的等級一致性進行了檢驗。該標準樣品已通過國家標準化管理委員會組織的專家評審，并獲得全國標準樣品技術(shù)委員會頒發(fā)的有證標準樣品證書GSB16-3424-2017。這是國內(nèi)首套指紋圖譜分級茶葉標準樣品，具有量化分級的特征。

該茶樣標準樣品填補了信陽毛尖茶國家實物標準樣品的空白，可用于信陽毛尖茶的分等定級。通過建立未知等級信陽毛尖茶樣品和一級標準樣品滋味成分HPLC指紋圖譜，以信陽毛尖茶一級標準樣品指紋圖譜為參照，以15 個信陽毛尖茶特征滋味物質(zhì)相對峰面積為原始數(shù)據(jù)，計算未知茶樣與一級標準樣品間指紋圖譜的相似度大小，并與信陽毛尖茶一級、二級、三級標注茶樣的相似度定值結(jié)果相比對，來確定未知茶樣的等級。基于該標準樣品的茶葉分級方法可以作為感官分級方法的一個有力補充。所建立的基于指紋圖譜的茶葉分級標準樣品研制方法可以為其他茶葉標準樣品的研制提供參考。