陳 佳，王 爽，周 巍，張 巖,*，桑亞新,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.山東省標(biāo)準(zhǔn)化研究院，山東 濟(jì)南 250000；3.河北省食品檢驗(yàn)研究院 河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050071）

淀粉是現(xiàn)代食品加工業(yè)中一種重要的生產(chǎn)原料，也可以作為一種重要的工業(yè)原料用于膠黏、填充等途徑中[1]。目前常見的淀粉種類有馬鈴薯淀粉、番薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、麥類淀粉等。其超微形態(tài)、糊化溫度等理化性質(zhì)存在一定的差異，原材料成本及加工工藝的不同也造成了價(jià)格大有差別[2-5]。隨著淀粉加工、深加工產(chǎn)品的豐富，淀粉偽造或摻假問題日益突出。目前市場上發(fā)現(xiàn)的摻假淀粉總體分為兩類，一類是在淀粉及淀粉制品中摻入滑石粉、白陶土、非食用色素等雜質(zhì)以次充好，一類是摻入價(jià)格較低廉的植物淀粉投機(jī)銷售，如在馬鈴薯淀粉中摻入玉米[6]、苜蓿、蕎麥等。雖然后者的摻假現(xiàn)象等不會(huì)對(duì)人體健康造成嚴(yán)重影響，但理化性質(zhì)的差異會(huì)影響食品的成色、品質(zhì)，并且冒充高價(jià)格的淀粉銷往市場謀取非法利潤，嚴(yán)重?cái)_亂市場秩序，對(duì)合法生產(chǎn)者和消費(fèi)者來說都是一種損害。

因此，加強(qiáng)對(duì)淀粉及其制品的鑒別檢驗(yàn)極為重要。淀粉的檢測主要由感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和衛(wèi)生指標(biāo)3 項(xiàng)綜合指標(biāo)組成[1]。感官檢測方法簡單但檢測結(jié)果僅能作為輔助參考。理化檢測耗時(shí)費(fèi)力，并且對(duì)于第2類摻假問題難以準(zhǔn)確鑒別。目前對(duì)淀粉摻假研究的檢測方法有掃描電鏡、穩(wěn)定碳同位素比質(zhì)譜技術(shù)[7]、碘試劑顯色反應(yīng)等。準(zhǔn)確判定淀粉摻假，確保食品標(biāo)簽制度的有效實(shí)施，需要靈敏、可靠的檢測方法鑒定植物源食品的物種來源。

DNA條形碼技術(shù)基本原理是利用標(biāo)準(zhǔn)的、具有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段在種內(nèi)的特異性和種間多樣性，實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的快速自動(dòng)鑒定[8-10]。目前該技術(shù)在植物領(lǐng)域的研究和應(yīng)用稍落后于動(dòng)物類群的研究[11-17]，植物DNA條形碼的選擇及評(píng)價(jià)缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。目前植物領(lǐng)域DNA條形碼候選片段主要集中于葉綠體和核糖體中，主要包括成熟酶K蛋白（maturase K protein，matK）、質(zhì)體trnH-psbA間隔區(qū)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，rbcL）、核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）等其他單片段[9,18-19]。但大量研究結(jié)果表明，單一片段的植物DNA條形碼存在一定局限性而分辨率較低，因此有研究[20-21]提出植物條形碼片段組合理念，利用優(yōu)勢互補(bǔ)提高植物種類的鑒定識(shí)別率。研究表明陸地植物中較為可行的組合是rbcL（科級(jí)）＋matK（屬級(jí)）＋I(xiàn)TS和trnH-psbA（種級(jí)）[8]。目前國內(nèi)對(duì)于DNA條形碼技術(shù)的研究重要集中在單一科屬動(dòng)植物的分類鑒定[22-23]，對(duì)于食品摻假鑒定的相關(guān)文獻(xiàn)較少[24-25]，尤其是植物性食品摻假鑒定方面鮮有報(bào)道。

本研究使用ITS2、rbcL、matK、trnH-psbA序列的通用引物對(duì)苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯、玉米5大淀粉原物種進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增和測序比對(duì)，比較各序列的擴(kuò)增效率和測序成功率，評(píng)價(jià)不同DNA條形碼候選序列對(duì)淀粉原物種的鑒別能力，篩選出較適合的DNA條形碼組合，并對(duì)市售淀粉及粉條制品進(jìn)行物種鑒定和摻假判定，為植物DNA條形碼技術(shù)在植物源食品的檢測技術(shù)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究用樣本主要選擇淀粉加工類品種，苜蓿（青海苜蓿、本草苜蓿）、馬鈴薯（系薯1號(hào)、安薯56號(hào)、晉薯5號(hào)）、木薯（華南7號(hào)、華南8號(hào)、面包木薯）、番薯（商薯9號(hào)、漯薯10號(hào)、徐薯32號(hào)、渝薯17號(hào)）、玉米（良玉99、登海6702、中單909）由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，待測樣本5 種淀粉、4 種粉條制品均為市購。

植物基因組DNA提取試劑盒、PremixTaq、Marker（1 000 bp） 寶生物工程（大連）有限公司；GelRed、瓊脂糖 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LX-100手掌型離心機(jī) 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DYY-III2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠；BS-124S分析天平 北京賽馬利斯公司；紫外凝膠成像系統(tǒng)、S1000 thermal cycler基因擴(kuò)增儀 美國伯樂公司；1-15pk冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；NanoDrop 1000微量核算蛋白測定儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

陽性樣本及待測樣本基因組DNA提取均采用植物基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒使用手說明書進(jìn)行基因組DNA提取。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增所用通用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表1。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

PCR體系（50 μL）：模板DNA 5 μL；PremixTaq25 μL；正向引物（10 μmol/L）2 μL；反向引物（10 μmol/L）2 μL；無菌水定容到50 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 30 s，54～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，反應(yīng)36 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用凝膠成像系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3.3 PCR產(chǎn)物測序及比對(duì)

PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序，測序引物同于擴(kuò)增引物。所得的測序結(jié)果經(jīng)拼接并刪除兩端引物序列，提交GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.3.4 引物通用性驗(yàn)證

將苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯、玉米分別按照1.3.1節(jié)進(jìn)行基因組DNA提取，經(jīng)PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測序比對(duì)后驗(yàn)證選擇引物對(duì)的通用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA條形碼序列片段的擴(kuò)增

提取苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯、玉米5大物種基因組DNA，分別以ITS2、matK、rbcL和trnH-psbA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以無菌水作為模板進(jìn)行陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。綜合分析，ITS2和trnH-psbA擴(kuò)增效率較高，在陽性樣本的苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯和玉米中均擴(kuò)增出清晰的條帶。ITS2序列擴(kuò)增條帶大小在500 bp左右，其中在馬鈴薯中還擴(kuò)增出700 bp左右大小的非特異條帶。trnH-psbA在苜蓿、馬鈴薯、木薯中擴(kuò)增出600 bp大小的條帶，而在番薯和玉米中分別得到300 bp和700 bp大小的條帶，擴(kuò)增條帶大小差異顯著。matK序列引物的通用性較差，僅在馬鈴薯和紅薯中擴(kuò)增出條帶，其中馬鈴薯中的條帶較弱，擴(kuò)增效果較差。而rbcL序列通用引物在苜蓿和番薯中呈現(xiàn)清晰單一的擴(kuò)增條帶，在馬鈴薯擴(kuò)增結(jié)果中有非特異的較大片段，而在木薯中擴(kuò)增效率較低。

圖1 陽性樣品4 種基因片段的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 1 Electrophoresis patterns of 4 genes amplified by PCR frompositive samples

2.2 PCR產(chǎn)物測序成功率

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司雙向測序，測序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果如表2所示。ITS2基因分別在苜蓿、番薯和玉米樣品中比對(duì)成功，而在馬鈴薯樣品中比對(duì)結(jié)果為番茄，且相似率僅為80%，物種特異性較差。matK基因分別在馬鈴薯和番薯樣品中擴(kuò)增出條帶，但在馬鈴薯樣品中擴(kuò)增條帶較弱，比對(duì)失敗，而在番薯中比對(duì)成功，相似率為99%。rbcL基因?qū)︸R鈴薯和番薯的靈敏性較高，而在苜蓿中未得到理想比對(duì)結(jié)果。trnH-psbA基因的測序成功率較高，在苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯中均比對(duì)成功，但在玉米樣品中比對(duì)結(jié)果為束尾草屬植物。

表2 不同DNA序列GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)鑒定結(jié)果Table 2 Results of sequencing and identification in alignment with GenBank

為進(jìn)一步對(duì)DNA條形碼序列進(jìn)行評(píng)價(jià)和篩選，對(duì)4 個(gè)DNA序列的PCR擴(kuò)增效率（呈現(xiàn)清晰條帶即為判定成功）、測序成功率（測序比對(duì)成功）及序列有效獲得率（PCR擴(kuò)增效率×測序成功率）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，ITS2和trnH-psbA的序列有效獲得率較高，分別為60%和80%，而matK和rbcL片段的有效率僅為8%和24%。盡管統(tǒng)計(jì)樣本容量較小，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果仍為淀粉檢驗(yàn)DNA條形碼的有效選取提供一定的指導(dǎo)和參考。綜上分析，ITS2和trnH-psbA基因組合可作為候選基因片段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 不同DNA序列PCR擴(kuò)增及測序效率Table 3 Results of PCR amplification and sequencing by using different DNA sequences

2.3 引物通用性驗(yàn)證結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究獲得的ITS2和trnH-psbA引物組合通用性，對(duì)苜蓿（青海苜蓿、本草苜蓿）、馬鈴薯（系薯1號(hào)、安薯56號(hào)、晉薯5號(hào)）、木薯（華南7號(hào)、華南8號(hào)、面包木薯）、番薯（商薯9號(hào)、漯薯10號(hào)、徐薯32號(hào)、渝薯17號(hào)）、玉米（良玉99、登海6702、中單909）進(jìn)行DNA條形碼的引物驗(yàn)證。由表4可知，苜蓿、番薯、玉米3 個(gè)物種的不同品種均能通過ITS2引物擴(kuò)增并完成比對(duì)鑒定，苜蓿、馬鈴薯、木薯、番薯4 個(gè)物種的不同品種均能通過trnH-psbA引物擴(kuò)增并完成比對(duì)鑒定，因此可以說明ITS2和trnH-psbA引物組合的通用性良好。

表4 不同物種GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)鑒定結(jié)果Table 4 Results of sequencing and identification of different plant species in alignment with GenBank

2.4 實(shí)際樣品的DNA鑒定

試劑盒法提取抽檢的4 個(gè)粉條樣品和5 個(gè)淀粉樣品的基因組DNA，分別利用ITS2基因和trnH-psbA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以無菌水作DNA模板進(jìn)行陰性對(duì)照[26]，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。陰性對(duì)照組無擴(kuò)增條帶，證明PCR體系未污染。粉條和淀粉樣品均擴(kuò)增出400～600 bp大小的條帶，且條帶清晰未有雜帶，擴(kuò)增效率較高。

圖2 待測樣品基因片段的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 2 Electrophoresis profiles of genes amplified by PCR from samples

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序，并將測序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果均為苜蓿屬，結(jié)果如表5所示。

表5 抽檢樣品物種鑒定結(jié)果Table 5 Species identification of samples

為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，根據(jù)苜蓿葉綠體間隔區(qū)序列（HQ199041.1）設(shè)計(jì)苜蓿特異性引物Primer-F：5’-GACGTGTTTCGTAAAG-3’，Primer-R：5’-CTCGAAAAAAGCCTTCT-3’，進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。如表5所示，5 個(gè)淀粉樣品和3 個(gè)粉條樣品測序比對(duì)均為苜蓿，粉條4樣品因PCR擴(kuò)增效率低未得到結(jié)果。綜合分析以上結(jié)果，自行購買的粉條和淀粉樣品均摻有苜蓿成分，與樣品包裝標(biāo)簽成分不符，可判定為摻假樣品。

3 討 論

DNA條形碼技術(shù)是當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，它操作簡單，不受個(gè)體發(fā)育階段和形態(tài)特征的限制，并可以作為傳統(tǒng)分類學(xué)的輔助手段，解決物種鑒定分類等難題[9]。理想的DNA條形碼應(yīng)符合一些基本標(biāo)準(zhǔn)：1）具有足夠的遺傳變異性和一定的分化度；2）標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段；3）包含足夠的系統(tǒng)進(jìn)化信息；4）便于通用引物設(shè)計(jì)；5）目標(biāo)DNA足夠短，便于提取和擴(kuò)增。雖然DNA條形碼的研究仍存在一定的爭議，但其在動(dòng)物分類學(xué)中的研究已相對(duì)成熟，并選取動(dòng)物細(xì)胞色素C氧化酶I基因（coi）作為動(dòng)物界標(biāo)準(zhǔn)基因[27]。生命條形碼聯(lián)盟植物工作組決定將葉綠體中的rbcL和matK兩個(gè)基因片段作為植物DNA條形碼核心條碼，核基因的ITS片段和葉綠體中的trnH-psbA片段作為補(bǔ)充條碼[11]。

本研究結(jié)果顯示，ITS和trnH-psbA序列有效獲得率較高，并篩選出ITS2和trnH-psbA為較適片段組合，這與前人的研究結(jié)果一致。Kress等[18]認(rèn)為多基因片段組合可實(shí)現(xiàn)植物類群的條形碼鑒定，并提出ITS和trnH-psbA是較好的選擇。陳之端等[27]利用rbcL和ITS兩個(gè)DNA片段對(duì)樺木科6 屬36 種個(gè)體取樣分析，建立了樺木科的系統(tǒng)發(fā)育，揭示了樺木科屬間系統(tǒng)關(guān)系。陳士林等[28-29]在藥用植物中篩選DNA條形碼，發(fā)現(xiàn)ITS2在種級(jí)水平上的分辨率可以達(dá)到92.7%。侯新東等[30]對(duì)蕁麻科植物DNA條形碼篩選的研究中發(fā)現(xiàn)，trnH-psbA、ITS2、rbcL和matK序列有效獲得率分別為95.4%、92.3%、90.1%和0%，且trnH-psbA、ITS2、rbcL可作為鑒別蕁麻科植物的有效DNA組合。

植物性食源物種種類多且復(fù)雜，加工工藝的提高使得植物性制品的原料很難通過形態(tài)特征等判定。食品加工制造業(yè)的不法商家在加工品中摻雜使假、以次充好，以低價(jià)原料冒充高價(jià)原料加工銷售，擾亂公平競爭社會(huì)風(fēng)氣，損害消費(fèi)者和守法生產(chǎn)商的利益。本研究結(jié)合ITS2和trnH-psbA組合對(duì)抽檢的淀粉和粉條制品進(jìn)行鑒定，經(jīng)測序比對(duì)發(fā)現(xiàn)均摻有苜蓿成分。苜蓿與其他植物源材料相比，價(jià)格低廉。雖然摻入的苜蓿成分對(duì)人體無害，但其與產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)注不符，存在商業(yè)欺詐行為。植物DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用前景廣，但需要DNA條形碼數(shù)據(jù)庫序列的不斷完善，因此目前DNA條形碼在產(chǎn)品鑒定中的應(yīng)用較少。本研究為植物DNA條形碼技術(shù)的在植物源食品物種鑒定方面的應(yīng)用提供一定參考。