吳 波，謝 晶*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306）

石斑魚(yú)（Epinephelus）隸屬于鮨科（Serranidae），為暖水性魚(yú)類(lèi)，主要養(yǎng)殖于我國(guó)海南、廣東、福建及浙江沿海地區(qū)，且養(yǎng)殖量占中國(guó)總養(yǎng)殖量95%，占世界石斑魚(yú)總養(yǎng)殖量的80%以上，并呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，供給國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者[1-4]。石斑魚(yú)因其蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低，且肉質(zhì)細(xì)嫩、口感佳，而深得消費(fèi)者青睞，具有較高的市場(chǎng)價(jià)值和消費(fèi)需求，市場(chǎng)流通率高，因此石斑魚(yú)活體運(yùn)輸技術(shù)尤為重要[5-6]。

為保證石斑魚(yú)活體運(yùn)輸?shù)竭_(dá)更多更遠(yuǎn)的地方，多選擇有水活運(yùn)，期間鮮活石斑魚(yú)常常會(huì)因?yàn)樗w溫度、鹽度、氨氮、溶解氧含量等因素的變化而發(fā)生運(yùn)輸應(yīng)激，無(wú)論是輕度應(yīng)激還是重度應(yīng)激均會(huì)對(duì)魚(yú)體免疫功能、抗氧化功能、存活率產(chǎn)生不同程度的影響[7-8]。

在鮮活魚(yú)體有水活運(yùn)過(guò)程中，溫度和鹽度作為基礎(chǔ)環(huán)境因子，亦是誘發(fā)運(yùn)輸應(yīng)激的主要應(yīng)激源。過(guò)高或過(guò)低的溫度、鹽度會(huì)引發(fā)魚(yú)體應(yīng)激反應(yīng)，使魚(yú)體內(nèi)環(huán)境失衡，影響其免疫功能。一般通過(guò)測(cè)定魚(yú)體血清中皮質(zhì)醇、血糖含量變化來(lái)評(píng)價(jià)魚(yú)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的程度，進(jìn)而評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)生理機(jī)體健康狀況[9-14]。除此以外，熱休克蛋白（heat shock proteins 70，HSP70）也是反映魚(yú)體受到應(yīng)激反應(yīng)程度的重要指標(biāo)，從基因分子水平角度出發(fā)，當(dāng)魚(yú)體受到應(yīng)激源刺激時(shí)，HSP70的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變，從而修復(fù)和降解改變或變性的蛋白，起到指示應(yīng)激反應(yīng)的作用[15-16]。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者大多從免疫功能、抗氧化功能評(píng)價(jià)等角度研究了不同鮮活魚(yú)類(lèi)有水運(yùn)輸?shù)淖罴褱囟?、鹽度。范秀萍等[17]研究了溫度對(duì)石斑魚(yú)有水活運(yùn)過(guò)程中代謝和魚(yú)肉品質(zhì)的影響；王利娟等[18]研究了水溫對(duì)加州鱸魚(yú)保活運(yùn)輸?shù)挠绊?；王雯等[19]研究了不同鹽度對(duì)斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)血清離子濃度和激素水平的影響。已有文獻(xiàn)大多是從溫度或是鹽度等單一影響因素進(jìn)行?；罟に嚨难芯浚^少考慮溫度、鹽度對(duì)魚(yú)類(lèi)有水活運(yùn)的交互影響。本實(shí)驗(yàn)以石斑魚(yú)為材料，采用響應(yīng)面法研究溫度和鹽度的變化以及兩者之間的交互作用對(duì)石斑魚(yú)血清、肝中的皮質(zhì)醇、血糖和HSP70的影響，優(yōu)化石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝，以獲得最佳的運(yùn)輸水溫、鹽度條件。

1 材料與方法

1.1 材料

石斑魚(yú)（品種為珍珠龍膽石斑魚(yú)，俗稱(chēng)老虎斑）購(gòu)自上海市浦東新區(qū)蘆潮港，選取同一批體質(zhì)健康無(wú)傷病，平均體長(zhǎng)為（27.50±1.55）cm，平均體質(zhì)量為（500±120）g，加水充氧運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。石斑魚(yú)購(gòu)回后將其停食暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室水族箱48 h，暫養(yǎng)和運(yùn)輸密度均為2 kg/m3，水溫為27 ℃，鹽度為，空氣泵充氧，充氧速率為22 L/min，保證水中溶解氧含量不小于6 mg/L，pH 7.0，暫養(yǎng)期間每日50%換水。

1.2 儀器與設(shè)備

LX-100VTR模擬運(yùn)輸振動(dòng)臺(tái) 上海魯軒儀器設(shè)備廠；BS-200全自動(dòng)生化分析儀 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；SH-1000Lab-全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 北京宏昌信科技有限公司；LP-20水族箱三合一曝氣機(jī) 深圳市興日生實(shí)業(yè)有限公司；F2640型多點(diǎn)溫度采集儀 美國(guó)Fluke公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 上海艾測(cè)電子科技有限公司；HS 28A全自動(dòng)循環(huán)水冷機(jī) 廣東海利集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 不同溫度下有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)運(yùn)輸應(yīng)激的測(cè)定

將停食暫養(yǎng)后的石斑魚(yú)分為10、15、21、27 ℃和30 ℃共5 組，每組用魚(yú)20 條，分別置于5 個(gè)不同的120 L水族箱，以2 ℃/h降溫速率進(jìn)行降溫直至相應(yīng)溫度，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后將水族箱放置模擬振動(dòng)臺(tái)上弱振，振動(dòng)臺(tái)轉(zhuǎn)速為150 r/min，相當(dāng)于陸路運(yùn)輸中速率為20 km/h，并在運(yùn)輸0、3、10、17、24、48 h觀察其存活率并取樣，取樣時(shí)采用一次性無(wú)菌注射器尾動(dòng)脈抽血，靜置30 min，4 ℃、6 000 r/min離心15 min取其血清，放入－80 ℃冰箱保存；在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)用已消毒的剪刀和鑷子取其肝臟組織后放入－80 ℃冰箱保存，并盡快實(shí)驗(yàn)防止RNA降解。

1.3.2 不同鹽度下有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)運(yùn)輸應(yīng)激的測(cè)定

1.3.3 皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所的魚(yú)皮質(zhì)醇ELISA試劑盒。

1.3.4 血糖濃度的測(cè)定

采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定，以葡萄糖計(jì)。

1.3.5 HSP70相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

采用上海捷瑞動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑盒并進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，具體方法參考文獻(xiàn)[20]。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)篩選出適宜石斑魚(yú)有水活運(yùn)的溫度、鹽度范圍。采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，在用Design-Expert隨機(jī)編組時(shí)采用中心組合響應(yīng)面法，研究溫度和鹽度對(duì)石斑魚(yú)運(yùn)輸應(yīng)激的聯(lián)合效應(yīng)，其中，將血糖、皮質(zhì)醇含量作為響應(yīng)指標(biāo)，試驗(yàn)溫度范圍為15～27 ℃，鹽度范圍為10～30，將每個(gè)試驗(yàn)因子進(jìn)行水平編碼分別為－α、－1、0、1、α（|α|=1.414）。試驗(yàn)采用2因素5水平，由系統(tǒng)將溫度和鹽度隨機(jī)交叉組合形成13 組試驗(yàn)，其中，中心點(diǎn)重復(fù)5 次，試驗(yàn)平行測(cè)定3 次，每組試驗(yàn)樣本數(shù)量為10 尾，運(yùn)輸水溫度、鹽度根據(jù)軟件設(shè)計(jì)進(jìn)行設(shè)定，其余暫養(yǎng)及運(yùn)輸水條件參考1.1節(jié)，運(yùn)輸方式及取樣方式參考1.3.1節(jié)，在運(yùn)輸24 h時(shí)取其血清用以血糖、皮質(zhì)醇的測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 2016、SPSS 21.0、Design-Expert 8.06等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。其中，響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以 ±s表示。通過(guò)Design-Expert 8.06軟件建立二次回歸方程模型為：

式中：Y為響應(yīng)變量（皮質(zhì)醇、血糖）；T為溫度；S為鹽度；b0為回歸常數(shù)；b1、b2分別為溫度、鹽度一次效應(yīng)系數(shù)；b3為溫度、鹽度互作效應(yīng)系數(shù)；b4、b5為溫度、鹽度二次效應(yīng)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)運(yùn)輸應(yīng)激及存活率的影響

2.1.1 溫度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)存活率的影響

表1 石斑魚(yú)在不同溫度與保活時(shí)間下的存活率Table 1 Survival rates of grouper at different temperatures and transportation times

溫度是石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝的關(guān)鍵環(huán)境因子，嚴(yán)格控制運(yùn)輸水溫度是有水?；罟に囇芯康幕A(chǔ)，外界溫度的波動(dòng)會(huì)直接影響?hù)~(yú)體生理變化，影響?hù)~(yú)體的代謝速率，從而損傷機(jī)體，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致魚(yú)體死亡，直接影響其存活率。如表1所示，運(yùn)輸溫度為10 ℃時(shí)，石斑魚(yú)有水活運(yùn)開(kāi)始后出現(xiàn)死亡，運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)僅為3 h，過(guò)低的溫度無(wú)法使魚(yú)體進(jìn)入正常休眠狀態(tài)，屬于不可接受溫度范圍，造成機(jī)體不可逆損傷直至死亡；運(yùn)輸溫度為30 ℃時(shí)，石斑魚(yú)有水活運(yùn)48 h時(shí)存活率僅為50%，且運(yùn)輸72 h時(shí)全部死亡，過(guò)高的溫度使魚(yú)體處于生命活動(dòng)旺盛期，促進(jìn)代謝的同時(shí)會(huì)增加水體氨氮含量不適宜魚(yú)體長(zhǎng)時(shí)間存活，且旺盛的生命活動(dòng)伴以模擬運(yùn)輸會(huì)給魚(yú)體帶來(lái)劇烈機(jī)體碰撞導(dǎo)致嚴(yán)重的機(jī)械損傷，因此，10 ℃和30 ℃均不適用作為石斑魚(yú)有水活運(yùn)水溫；運(yùn)輸溫度為15、21 ℃和27 ℃時(shí)，石斑魚(yú)有水活運(yùn)至少可維持72 h，且在運(yùn)輸48 h后存活率均高達(dá)95%以上，適宜作為石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝研究的水溫范圍；綜上，石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝研究的溫度范圍選擇15～27 ℃。宋志明[21]研究了溫度對(duì)暖水性魚(yú)類(lèi)點(diǎn)籃子魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)和代謝的影響，表明溫度在19～31 ℃范圍內(nèi)，其存活率均達(dá)到95%以上，與本研究結(jié)論相近。

2.1.2 溫度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量的影響

圖1 溫度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量的影響Fig. 1 Effect of water temperatures on serum cortisol concentration of grouper during water transportation

皮質(zhì)醇是反映魚(yú)體應(yīng)激的指示性指標(biāo)，當(dāng)魚(yú)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，會(huì)引起各項(xiàng)激素水平變化，而皮質(zhì)醇則是反應(yīng)鏈中分泌的最后一種激素，隨著應(yīng)激強(qiáng)度的增大，皮質(zhì)醇含量也會(huì)不同程度上升[22]。如圖1所示，15、21、27 ℃和30 ℃組石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在運(yùn)輸3 h時(shí)達(dá)到最大，且在該點(diǎn)30 ℃組石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量顯著高于其余3 組（P＜0.05），說(shuō)明高溫使石斑魚(yú)產(chǎn)生了劇烈的應(yīng)激反應(yīng)，分泌大量皮質(zhì)醇，不適宜作為石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝的溫度范圍，在運(yùn)輸剛開(kāi)始時(shí)，魚(yú)體無(wú)法及時(shí)適應(yīng)運(yùn)輸振動(dòng)帶來(lái)的刺激，均產(chǎn)生了不同程度的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致皮質(zhì)醇含量上升；15 ℃組石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量顯著低于其余3 組（P＜0.05），低溫使石斑魚(yú)處于半休眠狀態(tài)，其新陳代謝活動(dòng)、分泌激素能力均比其余組石斑魚(yú)弱；21 ℃組與27 ℃組介于其余2 組之間，總體而言，隨著溫度降低，皮質(zhì)醇含量呈下降的趨勢(shì)，由此，石斑魚(yú)有水活運(yùn)較適宜的溫度范圍為15～27 ℃。邵彥翔等[23]以雜交石斑魚(yú)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究高溫突變對(duì)其血清指標(biāo)產(chǎn)生的影響，研究結(jié)果同樣顯示高溫脅迫下的雜交石斑魚(yú)與對(duì)照組相比皮質(zhì)醇含量顯著升高。

2.1.3 溫度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)血糖濃度的影響

應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，生命活動(dòng)劇烈、新陳代謝旺盛會(huì)使魚(yú)體血糖濃度上升，當(dāng)應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，魚(yú)體不斷消耗能量，則魚(yú)體內(nèi)的血糖被不斷分解用以能量的供給[24-25]，因而血糖濃度亦是魚(yú)類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)的指示性指標(biāo)。如圖2所示，4 組不同溫度運(yùn)輸組魚(yú)體內(nèi)血糖濃度均呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在運(yùn)輸10 h時(shí)血糖濃度達(dá)到最大，在該點(diǎn)15 ℃組魚(yú)體血糖濃度顯著低于其余3 組（P＜0.05），而30 ℃組魚(yú)體血糖濃度顯著高于其余3 組（P＜0.05），說(shuō)明應(yīng)激反應(yīng)劇烈不適宜運(yùn)輸，在活魚(yú)運(yùn)輸初期因魚(yú)體需適應(yīng)模擬運(yùn)輸振動(dòng)產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，因15 ℃組的魚(yú)體為休眠狀態(tài)，其生命活動(dòng)遠(yuǎn)少于其余組，則應(yīng)激反應(yīng)較弱，相反，30 ℃組魚(yú)體生命活動(dòng)過(guò)多導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)劇烈?？傮w而言，魚(yú)體血糖濃度變化速率隨溫度降低而減緩，差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明應(yīng)激反應(yīng)程度隨著溫度降低而得到緩解，因此，石斑魚(yú)有水活運(yùn)較適宜的溫度范圍為15～27 ℃。Pilinkovskij等[26]研究運(yùn)輸脅迫對(duì)大西洋鱘血清指標(biāo)產(chǎn)生的影響，研究結(jié)果顯示運(yùn)輸脅迫會(huì)使魚(yú)體內(nèi)血糖水平顯著升高且與對(duì)照組差異顯著。

2.1.4 溫度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)HSP70表達(dá)量的影響

圖3 溫度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)HSP70表達(dá)量的影響Fig. 3 Effect of water temperature on HSP70 mRNA expression of grouper during transportation

HSP70是應(yīng)激時(shí)常被研究的指示性指標(biāo)，它能促進(jìn)新生多肽鏈的折疊，并促進(jìn)變異或變性的蛋白質(zhì)修復(fù)和降解。在魚(yú)類(lèi)中，當(dāng)魚(yú)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)會(huì)促進(jìn)HSP70轉(zhuǎn)錄，HSP70水平的升高有助于保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激源刺激損傷，從而保護(hù)機(jī)體免受損傷，提高魚(yú)體存活率[27]。如圖3所示，4 組不同運(yùn)輸溫度組石斑魚(yú)肝臟HSP70轉(zhuǎn)錄水平隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)；30 ℃運(yùn)輸組，石斑魚(yú)肝臟HSP70轉(zhuǎn)錄水平整體顯著高于其余3 組，且17 h后HSP70轉(zhuǎn)錄水平逐漸恢復(fù)但并未恢復(fù)到初始水平，說(shuō)明應(yīng)激反應(yīng)對(duì)肝臟造成了不可逆的損傷，因此不適宜用于石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝的溫度；而15、21 ℃和27 ℃運(yùn)輸組HSP70轉(zhuǎn)錄水平均可逐步恢復(fù)至初始狀態(tài)，說(shuō)明肝臟損傷可修復(fù)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因魚(yú)體處于模擬運(yùn)輸狀態(tài)，溫度的差異、振動(dòng)的影響均會(huì)使魚(yú)體產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，15 ℃組因其魚(yú)體進(jìn)入休眠狀態(tài)而減少生命活動(dòng)降低代謝速率，30 ℃組使魚(yú)體處于超適宜生存溫度，促進(jìn)其代謝，不僅使運(yùn)輸水質(zhì)進(jìn)一步惡化，劇烈的應(yīng)激反應(yīng)往往會(huì)造成不可逆損傷。羅勝玉等[28]研究顯示溫度的突變會(huì)誘發(fā)魚(yú)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，引發(fā)HSP70蛋白含量激增，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，其含量可恢復(fù)至初始狀態(tài)。

2.2 鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)運(yùn)輸應(yīng)激及存活率的影響

2.2.1 鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)存活率的影響

表2 石斑魚(yú)在不同鹽度與保活時(shí)間下的存活率Table 2 Survival rates of grouper at different salinities and transportation times

2.2.2 鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量的影響

如圖4所示，4 組不同鹽度運(yùn)輸水組的石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)且在運(yùn)輸3 h時(shí)達(dá)到最高，且40組石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇整體水平顯著高于其余3 組（P＜0.05），說(shuō)明其應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，該鹽度水平不適于石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝，過(guò)高的鹽度使魚(yú)體生存過(guò)程中無(wú)法適應(yīng)，機(jī)體內(nèi)環(huán)境失衡，通過(guò)劇烈的應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行自身調(diào)節(jié)，長(zhǎng)時(shí)間抗應(yīng)激反應(yīng)造成不可逆損傷；3 個(gè)不同鹽度組石斑魚(yú)的血清皮質(zhì)醇整體水平隨鹽度的增加而降低，說(shuō)明高鹽度組的魚(yú)體應(yīng)激水平顯著低于低鹽度組（P＜0.05），因此，石斑魚(yú)有水活運(yùn)適宜的運(yùn)輸水鹽度范圍為10～ 30。王雯等[19]研究了斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)在不同鹽度下血清離子濃度和激素水平的變化，結(jié)果顯示5‰和10鹽度組魚(yú)體血清皮質(zhì)醇水平顯著高于20鹽度組，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 鹽度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量的影響Fig. 4 Effect of salinity on serum cortisol level of grouper during transportation

2.2.3 鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)血糖濃度的影響

圖5 鹽度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血糖濃度的影響Fig. 5 Effect of salinity on blood glucose level of grouper during transportation

由圖5可知，石斑魚(yú)有水活運(yùn)過(guò)程中魚(yú)體血糖濃度均隨運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，40組魚(yú)體血糖濃度整體顯著高于其余3 組（P＜0.05），且變化速率快，不利于石斑魚(yú)中長(zhǎng)途運(yùn)輸；20組魚(yú)體血糖濃度整體顯著低于其余3 組（P＜0.05），且變化速率緩慢，變化不明顯，說(shuō)明低鹽度組石斑魚(yú)應(yīng)激反應(yīng)較弱，適宜中長(zhǎng)途運(yùn)輸。10～30可作為石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝鹽度范圍。不同鹽度水環(huán)境使魚(yú)體產(chǎn)生不同程度應(yīng)激反應(yīng)，過(guò)高鹽度使魚(yú)體產(chǎn)生劇烈應(yīng)激反應(yīng)，在其抗應(yīng)激過(guò)程中需大量血糖分解以供給能量，血糖濃度變化速率快，抗應(yīng)激強(qiáng)度大。徐鋼春等[13]研究了鹽度對(duì)刀鱭運(yùn)輸應(yīng)激指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致魚(yú)體血糖濃度上升，且加鹽組魚(yú)體血糖濃度隨運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)趨于平穩(wěn)，適宜的鹽度可降低魚(yú)體應(yīng)激反應(yīng)。

2.2.4 鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)HSP70表達(dá)量的影響

圖6 鹽度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)HSP70表達(dá)量的影響Fig. 6 Effect of salinity on HSP70 mRNA expression of grouper during transportation

如圖6所示，4 組不同鹽度處理下的運(yùn)輸組，石斑魚(yú)肝臟HSP70表達(dá)量均隨運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，且隨著鹽度的升高，HSP70表達(dá)量逐漸降低。40‰運(yùn)輸組整體HSP70表達(dá)量顯著高于其余3 組（P＜0.05），且最終并未恢復(fù)至初始狀態(tài)，表明石斑魚(yú)肝臟受到不可逆的機(jī)體損傷；而10、20、 30運(yùn)輸組石斑魚(yú)肝臟HSP70表達(dá)量隨運(yùn)輸時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降可恢復(fù)至初始水平，說(shuō)明石斑魚(yú)在有水活運(yùn)過(guò)程中肝臟受損可修復(fù)。由于石斑魚(yú)肝臟HSP70表達(dá)量隨著鹽度的增大呈下降趨勢(shì)，兩者呈線(xiàn)性關(guān)系，并不適合在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)值。30鹽度更適于石斑魚(yú)有水活運(yùn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)Design-Expert 8.0軟件對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到血糖、皮質(zhì)醇對(duì)溫度（T）和鹽度（S）的二次多項(xiàng)回歸方程分別為：

血糖=－30.129 99＋2.763 55T＋0.485 91S－0.040 000TS－0.038 628T2＋1.968 75S2

皮質(zhì)醇=－261.841 42＋24.049 85T＋4.352 06S－3.625 7TS－3.277 5T2＋0.019 056S2

表4 溫度和鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)血糖濃度影響的回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the effects of temperature and salinity on blood glucose level of grouper during transportation

表5 溫度和鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)皮質(zhì)醇含量影響的回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the effects of temperature and salinity on serum cortisol levelof grouper during transportation

如表4、5所示，建立的模型P值均小于0.000 1，極顯著（P＜0.01），說(shuō)明建立的模型有效。失擬項(xiàng)F值分別為6.38、5.39，表明擬合方程有效，且方程的決定系數(shù)分別為0.976 6、0.975 5，校正系數(shù)分別為0.959 9、0.958 0，說(shuō)明2 個(gè)方程擬合度均極高，所選模型準(zhǔn)確。一次項(xiàng)、交互相回歸系數(shù)均極顯著，說(shuō)明溫度、鹽度以及交互作用對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血糖、皮質(zhì)醇有極其顯著的影響；二次項(xiàng)T2回歸系數(shù)極顯著，說(shuō)明溫度的二次效應(yīng)對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血糖、皮質(zhì)醇影響極其顯著；二次項(xiàng)S2回歸系數(shù)不顯著，表明鹽度的二次效應(yīng)對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血糖、皮質(zhì)醇基本無(wú)影響。

2.4 響應(yīng)面分析

圖7 溫度和鹽度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血糖濃度（a）、皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度（b）影響的響應(yīng)面圖Fig. 7 Response surface plots showing the effect of temperature and salinity on blood glucose concentration (a) and serum cortisol concentration (b) of grouper during transportation

如圖7所示，2 個(gè)曲面較陡，說(shuō)明溫度和鹽度對(duì)血糖濃度、皮質(zhì)醇含量的交互作用明顯，當(dāng)鹽度一定時(shí)，石斑魚(yú)血糖濃度、皮質(zhì)醇含量均隨溫度升高呈先升高后下降的趨勢(shì)；當(dāng)溫度一定時(shí)，兩者隨著鹽度的升高呈下降趨勢(shì)。

2.5 優(yōu)化工藝的確定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

綜上可知，根據(jù)響應(yīng)面軟件分析篩選得出，石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝最優(yōu)溫度16.76 ℃、鹽度26，在該試驗(yàn)條件下石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度為16.44 ng/L，血糖濃度為1.83 mmol/L。根據(jù)實(shí)際可操作性，將其修正為：溫度16 ℃、鹽度26。在修正的優(yōu)化條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，平行測(cè)定3 次，得到的石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度為（15.83±1.07）ng/L，血糖濃度為（1.93±0.17）mmol/L，經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)實(shí)際值均與預(yù)測(cè)值比較接近，說(shuō)明響應(yīng)面法獲得的石斑魚(yú)有水活運(yùn)優(yōu)化工藝是準(zhǔn)確、可行的。

3 結(jié) 論

石斑魚(yú)有水活運(yùn)過(guò)程中，溫度和鹽度的變化均使石斑魚(yú)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)從而影響其存活率、血清皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度、血糖濃度以及肝臟HSP70表達(dá)量。由溫度、鹽度實(shí)驗(yàn)分別得出石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝溫度范圍為15～27 ℃、鹽度范圍10～ 30。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝，得到石斑魚(yú)有水活運(yùn)最佳溫度為16 ℃，鹽度為26，在此條件下，石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇為（15.83±1.07）ng/L，血糖濃度為（1.93±0.17）mmol/L，為推薦的有水活運(yùn)工藝。