吳 波,謝 晶*
(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái),食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué)),上海 201306)
石斑魚(yú)(Epinephelus)隸屬于鮨科(Serranidae),為暖水性魚(yú)類(lèi),主要養(yǎng)殖于我國(guó)海南、廣東、福建及浙江沿海地區(qū),且養(yǎng)殖量占中國(guó)總養(yǎng)殖量95%,占世界石斑魚(yú)總養(yǎng)殖量的80%以上,并呈增長(zhǎng)趨勢(shì),供給國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者[1-4]。石斑魚(yú)因其蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低,且肉質(zhì)細(xì)嫩、口感佳,而深得消費(fèi)者青睞,具有較高的市場(chǎng)價(jià)值和消費(fèi)需求,市場(chǎng)流通率高,因此石斑魚(yú)活體運(yùn)輸技術(shù)尤為重要[5-6]。
為保證石斑魚(yú)活體運(yùn)輸?shù)竭_(dá)更多更遠(yuǎn)的地方,多選擇有水活運(yùn),期間鮮活石斑魚(yú)常常會(huì)因?yàn)樗w溫度、鹽度、氨氮、溶解氧含量等因素的變化而發(fā)生運(yùn)輸應(yīng)激,無(wú)論是輕度應(yīng)激還是重度應(yīng)激均會(huì)對(duì)魚(yú)體免疫功能、抗氧化功能、存活率產(chǎn)生不同程度的影響[7-8]。
在鮮活魚(yú)體有水活運(yùn)過(guò)程中,溫度和鹽度作為基礎(chǔ)環(huán)境因子,亦是誘發(fā)運(yùn)輸應(yīng)激的主要應(yīng)激源。過(guò)高或過(guò)低的溫度、鹽度會(huì)引發(fā)魚(yú)體應(yīng)激反應(yīng),使魚(yú)體內(nèi)環(huán)境失衡,影響其免疫功能。一般通過(guò)測(cè)定魚(yú)體血清中皮質(zhì)醇、血糖含量變化來(lái)評(píng)價(jià)魚(yú)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的程度,進(jìn)而評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)生理機(jī)體健康狀況[9-14]。除此以外,熱休克蛋白(heat shock proteins 70,HSP70)也是反映魚(yú)體受到應(yīng)激反應(yīng)程度的重要指標(biāo),從基因分子水平角度出發(fā),當(dāng)魚(yú)體受到應(yīng)激源刺激時(shí),HSP70的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變,從而修復(fù)和降解改變或變性的蛋白,起到指示應(yīng)激反應(yīng)的作用[15-16]。
目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者大多從免疫功能、抗氧化功能評(píng)價(jià)等角度研究了不同鮮活魚(yú)類(lèi)有水運(yùn)輸?shù)淖罴褱囟?、鹽度。范秀萍等[17]研究了溫度對(duì)石斑魚(yú)有水活運(yùn)過(guò)程中代謝和魚(yú)肉品質(zhì)的影響;王利娟等[18]研究了水溫對(duì)加州鱸魚(yú)保活運(yùn)輸?shù)挠绊?;王雯等[19]研究了不同鹽度對(duì)斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)血清離子濃度和激素水平的影響。已有文獻(xiàn)大多是從溫度或是鹽度等單一影響因素進(jìn)行?;罟に嚨难芯浚^少考慮溫度、鹽度對(duì)魚(yú)類(lèi)有水活運(yùn)的交互影響。本實(shí)驗(yàn)以石斑魚(yú)為材料,采用響應(yīng)面法研究溫度和鹽度的變化以及兩者之間的交互作用對(duì)石斑魚(yú)血清、肝中的皮質(zhì)醇、血糖和HSP70的影響,優(yōu)化石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝,以獲得最佳的運(yùn)輸水溫、鹽度條件。
石斑魚(yú)(品種為珍珠龍膽石斑魚(yú),俗稱(chēng)老虎斑)購(gòu)自上海市浦東新區(qū)蘆潮港,選取同一批體質(zhì)健康無(wú)傷病,平均體長(zhǎng)為(27.50±1.55)cm,平均體質(zhì)量為(500±120)g,加水充氧運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。石斑魚(yú)購(gòu)回后將其停食暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室水族箱48 h,暫養(yǎng)和運(yùn)輸密度均為2 kg/m3,水溫為27 ℃,鹽度為,空氣泵充氧,充氧速率為22 L/min,保證水中溶解氧含量不小于6 mg/L,pH 7.0,暫養(yǎng)期間每日50%換水。
LX-100VTR模擬運(yùn)輸振動(dòng)臺(tái) 上海魯軒儀器設(shè)備廠;BS-200全自動(dòng)生化分析儀 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;SH-1000Lab-全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 北京宏昌信科技有限公司;LP-20水族箱三合一曝氣機(jī) 深圳市興日生實(shí)業(yè)有限公司;F2640型多點(diǎn)溫度采集儀 美國(guó)Fluke公司;5810R高速冷凍離心機(jī) 上海艾測(cè)電子科技有限公司;HS 28A全自動(dòng)循環(huán)水冷機(jī) 廣東海利集團(tuán)。
1.3.1 不同溫度下有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)運(yùn)輸應(yīng)激的測(cè)定
將停食暫養(yǎng)后的石斑魚(yú)分為10、15、21、27 ℃和30 ℃共5 組,每組用魚(yú)20 條,分別置于5 個(gè)不同的120 L水族箱,以2 ℃/h降溫速率進(jìn)行降溫直至相應(yīng)溫度,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后將水族箱放置模擬振動(dòng)臺(tái)上弱振,振動(dòng)臺(tái)轉(zhuǎn)速為150 r/min,相當(dāng)于陸路運(yùn)輸中速率為20 km/h,并在運(yùn)輸0、3、10、17、24、48 h觀察其存活率并取樣,取樣時(shí)采用一次性無(wú)菌注射器尾動(dòng)脈抽血,靜置30 min,4 ℃、6 000 r/min離心15 min取其血清,放入-80 ℃冰箱保存;在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)用已消毒的剪刀和鑷子取其肝臟組織后放入-80 ℃冰箱保存,并盡快實(shí)驗(yàn)防止RNA降解。
1.3.2 不同鹽度下有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)運(yùn)輸應(yīng)激的測(cè)定
1.3.3 皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度的測(cè)定
采用南京建成生物工程研究所的魚(yú)皮質(zhì)醇ELISA試劑盒。
1.3.4 血糖濃度的測(cè)定
采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定,以葡萄糖計(jì)。
1.3.5 HSP70相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定
采用上海捷瑞動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒并進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),具體方法參考文獻(xiàn)[20]。
1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)
通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)篩選出適宜石斑魚(yú)有水活運(yùn)的溫度、鹽度范圍。采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì),在用Design-Expert隨機(jī)編組時(shí)采用中心組合響應(yīng)面法,研究溫度和鹽度對(duì)石斑魚(yú)運(yùn)輸應(yīng)激的聯(lián)合效應(yīng),其中,將血糖、皮質(zhì)醇含量作為響應(yīng)指標(biāo),試驗(yàn)溫度范圍為15~27 ℃,鹽度范圍為10~30,將每個(gè)試驗(yàn)因子進(jìn)行水平編碼分別為-α、-1、0、1、α(|α|=1.414)。試驗(yàn)采用2因素5水平,由系統(tǒng)將溫度和鹽度隨機(jī)交叉組合形成13 組試驗(yàn),其中,中心點(diǎn)重復(fù)5 次,試驗(yàn)平行測(cè)定3 次,每組試驗(yàn)樣本數(shù)量為10 尾,運(yùn)輸水溫度、鹽度根據(jù)軟件設(shè)計(jì)進(jìn)行設(shè)定,其余暫養(yǎng)及運(yùn)輸水條件參考1.1節(jié),運(yùn)輸方式及取樣方式參考1.3.1節(jié),在運(yùn)輸24 h時(shí)取其血清用以血糖、皮質(zhì)醇的測(cè)定。
采用Origin Pro 2016、SPSS 21.0、Design-Expert 8.06等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。其中,響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以 ±s表示。通過(guò)Design-Expert 8.06軟件建立二次回歸方程模型為:
式中:Y為響應(yīng)變量(皮質(zhì)醇、血糖);T為溫度;S為鹽度;b0為回歸常數(shù);b1、b2分別為溫度、鹽度一次效應(yīng)系數(shù);b3為溫度、鹽度互作效應(yīng)系數(shù);b4、b5為溫度、鹽度二次效應(yīng)系數(shù)。
2.1.1 溫度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)存活率的影響
表1 石斑魚(yú)在不同溫度與保活時(shí)間下的存活率Table 1 Survival rates of grouper at different temperatures and transportation times
溫度是石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝的關(guān)鍵環(huán)境因子,嚴(yán)格控制運(yùn)輸水溫度是有水?;罟に囇芯康幕A(chǔ),外界溫度的波動(dòng)會(huì)直接影響?hù)~(yú)體生理變化,影響?hù)~(yú)體的代謝速率,從而損傷機(jī)體,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致魚(yú)體死亡,直接影響其存活率。如表1所示,運(yùn)輸溫度為10 ℃時(shí),石斑魚(yú)有水活運(yùn)開(kāi)始后出現(xiàn)死亡,運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)僅為3 h,過(guò)低的溫度無(wú)法使魚(yú)體進(jìn)入正常休眠狀態(tài),屬于不可接受溫度范圍,造成機(jī)體不可逆損傷直至死亡;運(yùn)輸溫度為30 ℃時(shí),石斑魚(yú)有水活運(yùn)48 h時(shí)存活率僅為50%,且運(yùn)輸72 h時(shí)全部死亡,過(guò)高的溫度使魚(yú)體處于生命活動(dòng)旺盛期,促進(jìn)代謝的同時(shí)會(huì)增加水體氨氮含量不適宜魚(yú)體長(zhǎng)時(shí)間存活,且旺盛的生命活動(dòng)伴以模擬運(yùn)輸會(huì)給魚(yú)體帶來(lái)劇烈機(jī)體碰撞導(dǎo)致嚴(yán)重的機(jī)械損傷,因此,10 ℃和30 ℃均不適用作為石斑魚(yú)有水活運(yùn)水溫;運(yùn)輸溫度為15、21 ℃和27 ℃時(shí),石斑魚(yú)有水活運(yùn)至少可維持72 h,且在運(yùn)輸48 h后存活率均高達(dá)95%以上,適宜作為石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝研究的水溫范圍;綜上,石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝研究的溫度范圍選擇15~27 ℃。宋志明[21]研究了溫度對(duì)暖水性魚(yú)類(lèi)點(diǎn)籃子魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)和代謝的影響,表明溫度在19~31 ℃范圍內(nèi),其存活率均達(dá)到95%以上,與本研究結(jié)論相近。
2.1.2 溫度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量的影響
圖1 溫度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量的影響Fig. 1 Effect of water temperatures on serum cortisol concentration of grouper during water transportation
皮質(zhì)醇是反映魚(yú)體應(yīng)激的指示性指標(biāo),當(dāng)魚(yú)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí),會(huì)引起各項(xiàng)激素水平變化,而皮質(zhì)醇則是反應(yīng)鏈中分泌的最后一種激素,隨著應(yīng)激強(qiáng)度的增大,皮質(zhì)醇含量也會(huì)不同程度上升[22]。如圖1所示,15、21、27 ℃和30 ℃組石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量均呈先上升后下降的趨勢(shì),并在運(yùn)輸3 h時(shí)達(dá)到最大,且在該點(diǎn)30 ℃組石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量顯著高于其余3 組(P<0.05),說(shuō)明高溫使石斑魚(yú)產(chǎn)生了劇烈的應(yīng)激反應(yīng),分泌大量皮質(zhì)醇,不適宜作為石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝的溫度范圍,在運(yùn)輸剛開(kāi)始時(shí),魚(yú)體無(wú)法及時(shí)適應(yīng)運(yùn)輸振動(dòng)帶來(lái)的刺激,均產(chǎn)生了不同程度的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致皮質(zhì)醇含量上升;15 ℃組石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量顯著低于其余3 組(P<0.05),低溫使石斑魚(yú)處于半休眠狀態(tài),其新陳代謝活動(dòng)、分泌激素能力均比其余組石斑魚(yú)弱;21 ℃組與27 ℃組介于其余2 組之間,總體而言,隨著溫度降低,皮質(zhì)醇含量呈下降的趨勢(shì),由此,石斑魚(yú)有水活運(yùn)較適宜的溫度范圍為15~27 ℃。邵彥翔等[23]以雜交石斑魚(yú)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究高溫突變對(duì)其血清指標(biāo)產(chǎn)生的影響,研究結(jié)果同樣顯示高溫脅迫下的雜交石斑魚(yú)與對(duì)照組相比皮質(zhì)醇含量顯著升高。
2.1.3 溫度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)血糖濃度的影響
應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生,生命活動(dòng)劇烈、新陳代謝旺盛會(huì)使魚(yú)體血糖濃度上升,當(dāng)應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng),魚(yú)體不斷消耗能量,則魚(yú)體內(nèi)的血糖被不斷分解用以能量的供給[24-25],因而血糖濃度亦是魚(yú)類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)的指示性指標(biāo)。如圖2所示,4 組不同溫度運(yùn)輸組魚(yú)體內(nèi)血糖濃度均呈先上升后下降的趨勢(shì),并在運(yùn)輸10 h時(shí)血糖濃度達(dá)到最大,在該點(diǎn)15 ℃組魚(yú)體血糖濃度顯著低于其余3 組(P<0.05),而30 ℃組魚(yú)體血糖濃度顯著高于其余3 組(P<0.05),說(shuō)明應(yīng)激反應(yīng)劇烈不適宜運(yùn)輸,在活魚(yú)運(yùn)輸初期因魚(yú)體需適應(yīng)模擬運(yùn)輸振動(dòng)產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng),因15 ℃組的魚(yú)體為休眠狀態(tài),其生命活動(dòng)遠(yuǎn)少于其余組,則應(yīng)激反應(yīng)較弱,相反,30 ℃組魚(yú)體生命活動(dòng)過(guò)多導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)劇烈??傮w而言,魚(yú)體血糖濃度變化速率隨溫度降低而減緩,差異顯著(P<0.05),說(shuō)明應(yīng)激反應(yīng)程度隨著溫度降低而得到緩解,因此,石斑魚(yú)有水活運(yùn)較適宜的溫度范圍為15~27 ℃。Pilinkovskij等[26]研究運(yùn)輸脅迫對(duì)大西洋鱘血清指標(biāo)產(chǎn)生的影響,研究結(jié)果顯示運(yùn)輸脅迫會(huì)使魚(yú)體內(nèi)血糖水平顯著升高且與對(duì)照組差異顯著。
2.1.4 溫度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)HSP70表達(dá)量的影響
圖3 溫度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)HSP70表達(dá)量的影響Fig. 3 Effect of water temperature on HSP70 mRNA expression of grouper during transportation
HSP70是應(yīng)激時(shí)常被研究的指示性指標(biāo),它能促進(jìn)新生多肽鏈的折疊,并促進(jìn)變異或變性的蛋白質(zhì)修復(fù)和降解。在魚(yú)類(lèi)中,當(dāng)魚(yú)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)會(huì)促進(jìn)HSP70轉(zhuǎn)錄,HSP70水平的升高有助于保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激源刺激損傷,從而保護(hù)機(jī)體免受損傷,提高魚(yú)體存活率[27]。如圖3所示,4 組不同運(yùn)輸溫度組石斑魚(yú)肝臟HSP70轉(zhuǎn)錄水平隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì);30 ℃運(yùn)輸組,石斑魚(yú)肝臟HSP70轉(zhuǎn)錄水平整體顯著高于其余3 組,且17 h后HSP70轉(zhuǎn)錄水平逐漸恢復(fù)但并未恢復(fù)到初始水平,說(shuō)明應(yīng)激反應(yīng)對(duì)肝臟造成了不可逆的損傷,因此不適宜用于石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝的溫度;而15、21 ℃和27 ℃運(yùn)輸組HSP70轉(zhuǎn)錄水平均可逐步恢復(fù)至初始狀態(tài),說(shuō)明肝臟損傷可修復(fù)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因魚(yú)體處于模擬運(yùn)輸狀態(tài),溫度的差異、振動(dòng)的影響均會(huì)使魚(yú)體產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng),15 ℃組因其魚(yú)體進(jìn)入休眠狀態(tài)而減少生命活動(dòng)降低代謝速率,30 ℃組使魚(yú)體處于超適宜生存溫度,促進(jìn)其代謝,不僅使運(yùn)輸水質(zhì)進(jìn)一步惡化,劇烈的應(yīng)激反應(yīng)往往會(huì)造成不可逆損傷。羅勝玉等[28]研究顯示溫度的突變會(huì)誘發(fā)魚(yú)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),引發(fā)HSP70蛋白含量激增,隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng),其含量可恢復(fù)至初始狀態(tài)。
2.2.1 鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)存活率的影響
表2 石斑魚(yú)在不同鹽度與保活時(shí)間下的存活率Table 2 Survival rates of grouper at different salinities and transportation times
2.2.2 鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量的影響
如圖4所示,4 組不同鹽度運(yùn)輸水組的石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)且在運(yùn)輸3 h時(shí)達(dá)到最高,且40組石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇整體水平顯著高于其余3 組(P<0.05),說(shuō)明其應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈,該鹽度水平不適于石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝,過(guò)高的鹽度使魚(yú)體生存過(guò)程中無(wú)法適應(yīng),機(jī)體內(nèi)環(huán)境失衡,通過(guò)劇烈的應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行自身調(diào)節(jié),長(zhǎng)時(shí)間抗應(yīng)激反應(yīng)造成不可逆損傷;3 個(gè)不同鹽度組石斑魚(yú)的血清皮質(zhì)醇整體水平隨鹽度的增加而降低,說(shuō)明高鹽度組的魚(yú)體應(yīng)激水平顯著低于低鹽度組(P<0.05),因此,石斑魚(yú)有水活運(yùn)適宜的運(yùn)輸水鹽度范圍為10~ 30。王雯等[19]研究了斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)在不同鹽度下血清離子濃度和激素水平的變化,結(jié)果顯示5‰和10鹽度組魚(yú)體血清皮質(zhì)醇水平顯著高于20鹽度組,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
圖4 鹽度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇含量的影響Fig. 4 Effect of salinity on serum cortisol level of grouper during transportation
2.2.3 鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)血糖濃度的影響
圖5 鹽度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血糖濃度的影響Fig. 5 Effect of salinity on blood glucose level of grouper during transportation
由圖5可知,石斑魚(yú)有水活運(yùn)過(guò)程中魚(yú)體血糖濃度均隨運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì),40組魚(yú)體血糖濃度整體顯著高于其余3 組(P<0.05),且變化速率快,不利于石斑魚(yú)中長(zhǎng)途運(yùn)輸;20組魚(yú)體血糖濃度整體顯著低于其余3 組(P<0.05),且變化速率緩慢,變化不明顯,說(shuō)明低鹽度組石斑魚(yú)應(yīng)激反應(yīng)較弱,適宜中長(zhǎng)途運(yùn)輸。10~30可作為石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝鹽度范圍。不同鹽度水環(huán)境使魚(yú)體產(chǎn)生不同程度應(yīng)激反應(yīng),過(guò)高鹽度使魚(yú)體產(chǎn)生劇烈應(yīng)激反應(yīng),在其抗應(yīng)激過(guò)程中需大量血糖分解以供給能量,血糖濃度變化速率快,抗應(yīng)激強(qiáng)度大。徐鋼春等[13]研究了鹽度對(duì)刀鱭運(yùn)輸應(yīng)激指標(biāo)的影響,結(jié)果顯示運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致魚(yú)體血糖濃度上升,且加鹽組魚(yú)體血糖濃度隨運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)趨于平穩(wěn),適宜的鹽度可降低魚(yú)體應(yīng)激反應(yīng)。
2.2.4 鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)HSP70表達(dá)量的影響
圖6 鹽度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)HSP70表達(dá)量的影響Fig. 6 Effect of salinity on HSP70 mRNA expression of grouper during transportation
如圖6所示,4 組不同鹽度處理下的運(yùn)輸組,石斑魚(yú)肝臟HSP70表達(dá)量均隨運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì),且隨著鹽度的升高,HSP70表達(dá)量逐漸降低。40‰運(yùn)輸組整體HSP70表達(dá)量顯著高于其余3 組(P<0.05),且最終并未恢復(fù)至初始狀態(tài),表明石斑魚(yú)肝臟受到不可逆的機(jī)體損傷;而10、20、 30運(yùn)輸組石斑魚(yú)肝臟HSP70表達(dá)量隨運(yùn)輸時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降可恢復(fù)至初始水平,說(shuō)明石斑魚(yú)在有水活運(yùn)過(guò)程中肝臟受損可修復(fù)。由于石斑魚(yú)肝臟HSP70表達(dá)量隨著鹽度的增大呈下降趨勢(shì),兩者呈線(xiàn)性關(guān)系,并不適合在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)值。30鹽度更適于石斑魚(yú)有水活運(yùn)。
表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis
根據(jù)Design-Expert 8.0軟件對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得到血糖、皮質(zhì)醇對(duì)溫度(T)和鹽度(S)的二次多項(xiàng)回歸方程分別為:
血糖=-30.129 99+2.763 55T+0.485 91S-0.040 000TS-0.038 628T2+1.968 75S2
皮質(zhì)醇=-261.841 42+24.049 85T+4.352 06S-3.625 7TS-3.277 5T2+0.019 056S2
表4 溫度和鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)血糖濃度影響的回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the effects of temperature and salinity on blood glucose level of grouper during transportation
表5 溫度和鹽度對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中石斑魚(yú)皮質(zhì)醇含量影響的回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the effects of temperature and salinity on serum cortisol levelof grouper during transportation
如表4、5所示,建立的模型P值均小于0.000 1,極顯著(P<0.01),說(shuō)明建立的模型有效。失擬項(xiàng)F值分別為6.38、5.39,表明擬合方程有效,且方程的決定系數(shù)分別為0.976 6、0.975 5,校正系數(shù)分別為0.959 9、0.958 0,說(shuō)明2 個(gè)方程擬合度均極高,所選模型準(zhǔn)確。一次項(xiàng)、交互相回歸系數(shù)均極顯著,說(shuō)明溫度、鹽度以及交互作用對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血糖、皮質(zhì)醇有極其顯著的影響;二次項(xiàng)T2回歸系數(shù)極顯著,說(shuō)明溫度的二次效應(yīng)對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血糖、皮質(zhì)醇影響極其顯著;二次項(xiàng)S2回歸系數(shù)不顯著,表明鹽度的二次效應(yīng)對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血糖、皮質(zhì)醇基本無(wú)影響。
圖7 溫度和鹽度對(duì)有水活運(yùn)過(guò)程中石斑魚(yú)血糖濃度(a)、皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度(b)影響的響應(yīng)面圖Fig. 7 Response surface plots showing the effect of temperature and salinity on blood glucose concentration (a) and serum cortisol concentration (b) of grouper during transportation
如圖7所示,2 個(gè)曲面較陡,說(shuō)明溫度和鹽度對(duì)血糖濃度、皮質(zhì)醇含量的交互作用明顯,當(dāng)鹽度一定時(shí),石斑魚(yú)血糖濃度、皮質(zhì)醇含量均隨溫度升高呈先升高后下降的趨勢(shì);當(dāng)溫度一定時(shí),兩者隨著鹽度的升高呈下降趨勢(shì)。
綜上可知,根據(jù)響應(yīng)面軟件分析篩選得出,石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝最優(yōu)溫度16.76 ℃、鹽度26,在該試驗(yàn)條件下石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度為16.44 ng/L,血糖濃度為1.83 mmol/L。根據(jù)實(shí)際可操作性,將其修正為:溫度16 ℃、鹽度26。在修正的優(yōu)化條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,平行測(cè)定3 次,得到的石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度為(15.83±1.07)ng/L,血糖濃度為(1.93±0.17)mmol/L,經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)實(shí)際值均與預(yù)測(cè)值比較接近,說(shuō)明響應(yīng)面法獲得的石斑魚(yú)有水活運(yùn)優(yōu)化工藝是準(zhǔn)確、可行的。
石斑魚(yú)有水活運(yùn)過(guò)程中,溫度和鹽度的變化均使石斑魚(yú)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)從而影響其存活率、血清皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度、血糖濃度以及肝臟HSP70表達(dá)量。由溫度、鹽度實(shí)驗(yàn)分別得出石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝溫度范圍為15~27 ℃、鹽度范圍10~ 30。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化石斑魚(yú)有水活運(yùn)工藝,得到石斑魚(yú)有水活運(yùn)最佳溫度為16 ℃,鹽度為26,在此條件下,石斑魚(yú)血清皮質(zhì)醇為(15.83±1.07)ng/L,血糖濃度為(1.93±0.17)mmol/L,為推薦的有水活運(yùn)工藝。