祝 霞，劉 琦，趙丹丹，王璐璐，韓舜愈，楊學山,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

葡萄酒釀造是以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主導的一系列復雜的微生物代謝和生物轉化過程，同時還伴隨有醇類、酯類、酸類等多種揮發(fā)性香氣化合物生成[1-3]，它們的種類、濃度、閾值以及相互作用共同決定著葡萄酒的風格與特色[2]。在發(fā)酵過程中，釀酒酵母菌株的種類及接種量[3]、浸漬過程[4]、釀造條件[5]、營養(yǎng)成分[6]等均可影響葡萄酒發(fā)酵香氣化合物的產(chǎn)生。研究表明，使用不同釀酒酵母釀造的葡萄酒，其香氣特點差異較大。李景明等[7]比較了3 種釀酒酵母發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒香氣成分，結果發(fā)現(xiàn)D254酵母菌株產(chǎn)醇能力較強，CSM酵母菌株產(chǎn)酯能力較強，并且不同釀酒酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)生的香氣物質種類大致相同，但含量差異較大。Carrau等[3]分析了釀酒酵母接種量對發(fā)酵香氣的影響情況，結果表明，當釀酒酵母接種量為105CFU/L時，酯類、單萜類含量增加，高級醇和中鏈脂肪酸含量減少。氮源作為微生物重要的營養(yǎng)成分，其含量高低直接影響細胞的代謝過程，進而影響釀酒酵母菌株的產(chǎn)香性能。側鏈氨基酸轉氨酶[8]、醇酰基轉移酶[9]、醛脫氫酶[10]直接參與釀酒酵母發(fā)酵過程中香氣物質的合成，其中側鏈氨基酸轉氨酶與醇類香氣物質的形成有關，醇?；D移酶參與乙酯類物質的合成調(diào)控，醛脫氫酶主要參與脂肪酸的合成，它們的酶活性都與氮源濃度密切相關。發(fā)酵溫度主要影響釀酒酵母生長與代謝產(chǎn)物的生成。Molina等[11]在研究發(fā)酵溫度對釀酒酵母產(chǎn)香影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，低溫有利于酯類香氣的產(chǎn)生，但發(fā)酵溫度對高級醇的影響較為復雜。葡萄酒釀造過程以及發(fā)酵結束后常以偏重亞硫酸鹽的形式添加SO2，其主要作用是抑制雜菌生長和抗氧化作用，現(xiàn)有研究指出，添加SO2也會對發(fā)酵香氣產(chǎn)生一定影響。Sun Yumei等[12]研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵過程中SO2添加量的增加，2-苯乙醇和異丁醇的濃度增加，正丙醇、乙酸異戊酯和乳酸乙酯的濃度減少。此外，SO2的存在還可以使葡萄酒發(fā)酵過程中氨基酸、VC以及其他營養(yǎng)物質更多的保留，但過量的SO2會導致酵母產(chǎn)生雙乙酰等有害物質產(chǎn)生，這會嚴重影響葡萄酒質量[13]。目前關于不同發(fā)酵因素對葡萄酒香氣品質研究的報道較多，但進行不同釀造條件對不同種類發(fā)酵香氣綜合變化規(guī)律的研究較少。

本實驗利用葡萄汁模擬體系，接種5 株國產(chǎn)本土釀酒酵母菌株CY3079、LA-FR、LA-RA、MST和OFC進行發(fā)酵實驗，通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術對5 種釀酒酵母菌株產(chǎn)香特性進行比較，從而優(yōu)選得到1 株產(chǎn)香性能良好的酵母，并進一步研究氮源質量濃度、發(fā)酵溫度、pH值、SO2添加量4 個因素對該酵母菌株發(fā)酵香氣的影響，揭示不同條件下各類香氣組分的合成規(guī)律，以期為葡萄酒香氣風味調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌株CY3079、LA-FR、LA-RA、MST、OFC均由上海鼎唐國際貿(mào)易有限公司提供。

α-萜品醇、β-香茅醇、香葉醇、里那醇、(Z)-橙花叔醇、β-大馬士酮、乙酸異戊酯、乙酸乙酯、己酸甲酯、癸酸乙酯、戊醇、己醇、橙花醇、苯乙醇、金合歡醇（均為色譜純），2-辛醇（內(nèi)標物）標準品 美國Sigma公司；磷酸氫二銨、酒石酸氫鉀、檸檬酸、酒石酸，氫氧化鈉、偏重亞硫酸鈉、氯化鈉（均為分析純）天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

SPX-150-II生化培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；TRACE 1310-ISQ GC-MS儀、ISQ型單四極桿質譜儀美國Thermo Scientific公司；SPME裝置、萃取頭美國Supelco公司；PHS-3C pH計 上海雷磁有限責任公司；PAL-2數(shù)顯手持糖度計 日本ATAGO公司。

1.3 方法

1.3.1 模擬汁配制

為排除葡萄果實中品種香氣等香氣前體物質對實驗結果的影響，本實驗利用模擬葡萄汁研究不同發(fā)酵因素對發(fā)酵香氣的影響規(guī)律。模擬汁配方[14]：葡萄糖200 g/L、纖維二糖0.2 g/L；氮源：磷酸氫二銨1.5 g/L；酸：酒石酸氫鉀2.5 g/L、L-蘋果酸3.0 g/L、檸檬酸0.2 g/L；礦物質：磷酸氫二鉀1.14 g/L、硫酸鎂1.23 g/L。

1.3.2 釀酒酵母活化與模擬汁發(fā)酵

將釀酒酵母干粉溶于10 倍體積蒸餾水中，37 ℃靜置20 min，再加入等體積的模擬葡萄汁28 ℃活化25 min，按推薦用量（0.2 g/L）將活化好的釀酒酵母菌株接種到模擬葡萄汁中，最后轉移至28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進行發(fā)酵，待乙醇發(fā)酵結束后取樣檢測。

1.3.3 揮發(fā)性香氣成分萃取與分析檢測

參照魯榕榕等[15]的方法并略作修改，具體操作如下：

香氣成分的萃?。喝? mL待測酒樣于15 mL頂空瓶中，加入2.4 g氯化鈉和10 μL內(nèi)標物（質量濃度7.25 mg/L），加入磁力攪拌轉子，密封并搖勻，再置于恒溫磁力攪拌器中，40 ℃水浴平衡30 min后頂空萃取30 min。

G C-M S分析條件：D B-WA X毛細管色譜柱（60 m×2.5 mm，0.25 μm）；升溫程序：初溫50 ℃保持5 min，再以3.0 ℃/min升溫至200 ℃，保持15 min，高純氦氣（He）流速1 mL/min；進樣口溫度240 ℃，不分流進樣；MS接口溫度280 ℃；電子電離源；離子源能量70 eV；質量掃描范圍m/z20～350。

定性與定量：在質譜全離子掃描模式下，采用保留指數(shù)和NIST-11、Wiley及香精香料譜庫檢索比對進行定性分析。對已有標準品的化合物，利用標準曲線（R2＞0.995）定量，無標準品的化合物采用化學結構、官能團相似、碳原子數(shù)相近的標準物質進行半定量。

1.3.4 釀酒酵母菌株產(chǎn)香性能比較

將5 株釀酒酵母（CY3079、LA-FR、LA-RA、MST、OFC）按0.2 g/L接種量分別接種于不同三角瓶內(nèi)，28 ℃恒溫培養(yǎng)發(fā)酵，待乙醇發(fā)酵結束后進行香氣成分檢測，設置3 次重復實驗。

1.3.5 發(fā)酵條件對釀酒酵母菌株產(chǎn)香性能的影響

4 個發(fā)酵因素的研究采用控制變量法，即待研究因素按表1水平進行變化，其他因素均取表1中的中間水平，實驗設置3 次重復。其中1.0、1.5、2.0 g/L磷酸氫二銨相當于212.13、318.19、424.26 mg/L（以N計）。模擬汁的pH值用酒石酸與氫氧化鈉進行調(diào)節(jié)，SO2添加量用偏重亞硫酸鈉調(diào)節(jié)。

表1 發(fā)酵條件對釀酒酵母菌株產(chǎn)香性能的影響Table 1 Effects of different fermentation conditions on aromaproducing performance of S. cerevisiae strains

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Microsoft Office Excel 2010對實驗所得數(shù)據(jù)進行基本處理和作圖，使用IBM SPSS Statistics 19.0進行Duncan法多因素方差分析（P＜0.05，差異顯著）、多元回歸分析，并對香氣數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA），香氣物質含量結果均以 ±s表示。

2 結果與分析

2.1 不同釀酒酵母菌株產(chǎn)香性能比較結果

利用SPME-GC-MS對5 種釀酒酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)生的香氣物質進行分析，實驗共檢測到65 種香氣物質，其中醇類16 種、酯類22 種、酸類13 種、萜烯類9 種以及其他類5 種。由圖1可知，CY3079酵母菌株共檢出45 種香氣成分，LA-FR酵母檢出47 種，LA-RA、MST和OFC酵母分別檢出43、40 種和42 種。CY3079、OFC、MST酵母產(chǎn)高級醇的種類相對較多，并且MST酵母菌株的高級醇產(chǎn)量最高為512.954 μg/L。LA-FR酵母菌株的高級酯產(chǎn)量為344.664 μg/L，是MST和OFC酵母菌株的6.65 倍和3.83 倍。LA-FR酵母產(chǎn)萜烯能力最強，萜烯類產(chǎn)量為83.453 μg/L，明顯高于其他4 株酵母。發(fā)酵液中的揮發(fā)酸和其他類香氣物質含量相對較少，并且在5 種釀酒酵母間無顯著性差異。氣味活性值（odor activity value，OAV）是評價單一香氣化合物對整體香氣的貢獻程度[16]，因本實驗選用模擬葡萄汁進行發(fā)酵，不存在葡萄中的香氣前體物質，最終發(fā)酵產(chǎn)生的香氣物質含量遠低于正常葡萄酒，OAV大于1的香氣物質較少，因而本實驗統(tǒng)計了OAV大于0.1的香氣物質共9 種，LA-FR酵母產(chǎn)生的OAV大于0.1的香氣化合物最多，為8 種，LA-RA酵母5 種，CY3079酵母3 種。

圖1 釀酒酵母菌株產(chǎn)香特性比較Fig. 1 Comparison of aroma production characteristics of different S. cerevisiae strains

由于發(fā)酵香氣成分復雜，為直觀體現(xiàn)5 株釀酒酵母產(chǎn)香特點，故進行PCA，以特征值為1進行因子抽提，前2 個主成分累計方差貢獻率為96.895%，PC1和PC2貢獻率分別為82.544%和14.351%，基本能反映原數(shù)據(jù)的變異信息。如圖2所示，PC1主要反映了B7（棕櫚酸乙酯）、B5（癸酸乙酯）、D5（α-法尼烯）、D6（香葉醇）等花香、水果香味比較濃郁的香氣物質信息，A7（苯乙醇）和B8（乙酸苯乙酯）則與PC1高度負相關。PC2主要反映A8（十六醇）、E3（2-壬酮）等帶有脂肪味的香氣物質信息，D7（金合歡基乙醛）和A11（正庚醇）與PC2呈高度負相關。由圖3可知，根據(jù)這5 種酵母發(fā)酵特性可將其聚為3 類，其中LA-RA在PC1和PC2上的得分均較高，這主要代表葡萄酒中一些重要的酯類和萜烯類香氣物質信息，如B5（癸酸乙酯）、B14（乙酸異戊酯）、B7（棕櫚酸乙酯）、D5（α-法尼烯）、D6（香葉醇）等。OFC和MST酵母在PC1和PC2上的得分均較低，說明這類酵母產(chǎn)香能力較差，不適合高品質葡萄酒的釀造。LA-RA和CY3079酵母PC1得分較低，PC2得分較高，這一區(qū)域主要反映了一些醇類、酸類物質的信息，如A11（正庚醇）、C13（異丁酸）、C11（月桂酸），因而使用這類酵母釀的酒可能存在香氣品質單一、乙醇體積分數(shù)高等缺點。相比之下，LA-RA酵母產(chǎn)香性能優(yōu)于其他4 株酵母，并且產(chǎn)酯類、萜烯類物質能力最強，因此選擇該菌株研究不同釀造條件下發(fā)酵香氣的變化規(guī)律。

圖2 香氣化合物PCA的因子載荷圖Fig. 2 Loading plot of PCA for aroma compounds

圖3 釀酒酵母菌株發(fā)酵香氣PCA分布圖Fig. 3 PCA score plot of PC1 versus PC2 for aroma distribution of different strains of S. cerevisiae

2.2 釀造條件對LA-FR酵母菌株產(chǎn)香性能的影響

2.2.1 不同釀造條件下LA-FR酵母菌株發(fā)酵香氣檢測結果

發(fā)酵香氣主要是乙醇發(fā)酵過程中由酵母代謝合成的香氣化合物，本實驗利用SPME-GC-MS檢測了氮源、發(fā)酵溫度、pH值、SO2添加量4 個發(fā)酵因素的不同水平下模擬汁中的香氣物質，結果如表2所示。實驗共檢出65 種香氣化合物，其中醇類15 種，酯類23 種，酸類、萜烯及其他類分別為13、8、6 種。各發(fā)酵條件下香氣物質種類變化不大，但各類香氣物質含量存在顯著差異。葡萄酒發(fā)酵所需的最低氮含量為150 mg/L（相當于0.71 g/L磷酸氫二銨），氮含量過低會導致酵母生長緩慢，發(fā)酵遲緩或停滯，若氮含量超過500 mg/L（相當于2.36 g/L磷酸氫二銨）會導致危害健康的生物胺、氨基甲酸乙酯等產(chǎn)生[17]。由表2和圖4A可知，當?shù)促|量濃度從1.0 g/L增加到2.0 g/L時，高級醇含量降低了31.46%，其中直鏈高級醇含量減少41.76%，但由Ehrlich途徑合成支鏈高級醇如異丁醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-2-丁醇含量均有明顯增加；酯類含量與氮源質量濃度呈正相關，當?shù)促|量濃度為2.0 g/L時，酯類物質質量濃度為472.891 μg/L，相比1.0 g/L氮源時增加了72.92%，其中乙酸酯和乙基酯分別增加291.59%和62.49%。隨著氮源質量濃度的升高，萜烯含量降低42.56%，其中芳樟醇和反式-橙花叔醇含量降低最明顯，分別降低85.00%和31.38%，因此較低的氮源質量濃度發(fā)酵有利于高級酯等果香香氣物質的積累。

通常認為，低溫發(fā)酵有利于香氣化合物的積累，能降低發(fā)酵速率，延長發(fā)酵時間，可產(chǎn)生更多復雜的香氣組分，但溫度過低，有可能導致發(fā)酵停滯等風險[18]。由表2和圖4B可知，當發(fā)酵溫度升高時，香氣總量逐漸下降，其中酯類、萜烯類含量下降明顯，酸類含量顯著增加。發(fā)酵溫度從18 ℃升高到28 ℃，醇類物質總量先升高后降低，其中苯乙醇含量降低，1-己醇等六碳醇含量先增后降，其他直鏈高級醇和支鏈高級醇含量均有不同程度的增加；酯類物質含量下降58.66%，其中乙基酯和其他酯分別下降68.44%和91.89%，但乙酸酯含量增加了43.13%，如異戊酸乙酯、2-甲基己酸乙酯等均顯著降低，而乙酸苯乙酯含量有明顯的上升趨勢。較低的發(fā)酵溫度有利于萜烯類物質的積累，隨著發(fā)酵溫度的升高，萜烯化合物含量降低66.19%，其中芳樟醇與α-法尼烯含量下降明顯。當發(fā)酵溫度升高到28 ℃時，酸類物質含量明顯升高，如癸酸、2-甲基丁酸、異丁酸含量分別增加8.72、2.19、1.17 倍，酸類物質大量積累會破壞葡萄酒的平衡、降低酒的品質，因此較低溫度發(fā)酵有助于提升脂類、萜烯類香氣物質含量，但不利于醇類、酸類物質的積累。

表2 不同發(fā)酵條件下?lián)]發(fā)性香氣化合物GC-MS分析Table 2 GC-MS analysis of volatile aroma compounds produced under different fermentation conditions

續(xù)表2

圖4 發(fā)酵條件對發(fā)酵香氣含量的影響Fig. 4 Effect of different fermentation conditions on aroma production

如表2和圖4C所示，模擬汁的pH值由3.2升高到3.8的過程中，高級醇和酸類含量降低，酯類和萜烯類香氣化合物含量升高，高級醇含量減少30.24%，其中直鏈高級醇、硫醇含量顯著下降，但實驗中還發(fā)現(xiàn)部分支鏈高級醇含量有小幅度的增加，如異丁醇、2-甲基-1-丙醇；酯類、萜烯類含量分別增加19.50%和67.43%，其中乙酸酯和其他酯含量顯著增加，分別增加56.76%和48.96%。此外當pH值為3.8時，發(fā)酵產(chǎn)生的酸類物質減少34.16%。降低模擬汁的酸度不僅能增加帶有果香、花香味的高級酯和萜烯類香氣物質的含量，還能減少酸類物質積累所引起的異味，因此降低酸度對發(fā)酵香氣的改善意義重大。

SO2是葡萄酒中常用的抑菌劑，常以亞硫酸鹽的形式被添加[19]。由表2和圖4D可知，當SO2添加量從30 mg/L增加到70 mg/L時，高級醇含量升高5.82%，其中支鏈高級醇增加34.21%，但直鏈高級醇含量下降14.50%；隨著SO2添加量的增加，絕大部分酯類物質含量均有不同程度的增加，其中乙酸酯含量顯著增加，乙基酯和其他酯含量增幅較??；酸類和萜烯類含量分別降低47.41%和55.75%。隨著SO2添加量升高，叔十六硫醇和3-甲硫基丙醇這類對葡萄酒香氣有負面影響的硫化物含量明顯增加。高濃度的SO2對酵母細胞具有毒害作用，抑制酵母生長，并且SO2對人體健康也有一定的影響，因此在葡萄酒釀造過程中應合理減少SO2的用量，提高葡萄酒的安全性。

2.2.2 發(fā)酵條件對發(fā)酵香氣影響的多元回歸分析

由于不同發(fā)酵因素對各類香氣影響作用不同，并且各影響因素的量綱也不相同，因而不能直接比較各因素對香氣影響力的大小，故對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，再通過SPSS多元回歸分析求得標準回歸系數(shù)，其絕對值的大小直接反映了該因素對香氣的影響程度，正值表示該因素能增加香氣物質積累，負值則表示不利于香氣物質合成。

表3 各發(fā)酵因素的標準回歸系數(shù)Table 3 Standard regression coefficients for aroma compounds versusfermentation conditions

由表3可知，氮源質量濃度對醇類和酯類香氣物質含量影響最大，并且氮源質量濃度越高，醇類物質含量越低，酯類物質含量越高，因此增加氮源質量濃度可提高模擬汁中酯類香氣含量，但會降低醇類物質含量；發(fā)酵溫度對酸類物質影響最大，隨著發(fā)酵溫度升高，酸類物質生成增多，因此發(fā)酵過程中可通過控制溫度來避免因酸類物質大量積累而引起的香氣品質降低；發(fā)酵過程中SO2添加量對萜烯類香氣含量影響最大，其表現(xiàn)為抑制萜烯類物質的積累，因此控制好SO2添加量對發(fā)酵過程中萜烯類香氣物質調(diào)控具有重要意義。

3 討 論

釀酒酵母菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣物質種類繁雜，其中高級醇是發(fā)酵香氣中含量最高的組分，主要由Ehrlich途徑合成大量支鏈高級醇[20]，但Ehrlich途徑并非發(fā)酵過程中高級醇的唯一合成通路，少量直鏈高級醇是經(jīng)酵母體內(nèi)糖代謝途徑合成。酯類是除醇類外含量最高的呈香物質，并且種類最多，對提升葡萄酒香氣復雜性至關重要[21]。發(fā)酵香氣中的酯類大部分是酵母等微生物活動產(chǎn)生的中性酯，具有類似水果香氣，如淡淡的菠蘿和香蕉味[22]。酯類主要分為乙酸酯和乙基酯，乙酸酯是由高級醇和乙酰CoA經(jīng)醇乙?；D移酶催化生成，其中高級醇主要來自氨基酸代謝，乙酰CoA由丙酮酸氧化脫羧生成；乙基酯合成的底物是乙醇和?；鵆oA，由?；D移酶催化生成，主要包括丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯等[23]。葡萄酒中的酸類物質含量較少，其主要對葡萄酒的平衡起調(diào)節(jié)作用[24]。萜烯類化合物因其感官閾值較低，具有濃郁的花香味，對葡萄酒香氣貢獻尤為突出。早期研究認為酵母細胞內(nèi)不存在萜烯物質合成途徑，不能自身合成萜烯類化合物，但近年來出現(xiàn)了一些有關釀酒酵母菌株產(chǎn)萜烯的報道[25-26]。本實驗結果顯示釀酒酵母菌株可以合成少量萜烯類化合物，進而證實了酵母體內(nèi)存在萜烯合成途徑這一假說，但關于酵母細胞合成萜烯的具體途徑至今仍不清楚。

本研究結果表明，不同發(fā)酵條件均對模擬汁中香氣物質的組成、含量具有顯著影響。有文獻指出增加氮源濃度能提高側鏈氨基酸轉氨酶活性，從而使經(jīng)Ehrlich途徑生成的支鏈高級醇含量增加[27-28]，本實驗也得到類似的結果，但實驗中還發(fā)現(xiàn)隨著氮源質量濃度增加，部分直鏈高級醇含量減少，這可能是由于增加氮源質量濃度改變了模擬汁中的碳氮比，導致酵母細胞生長受到抑制，從而使經(jīng)糖代謝生成的直鏈高級醇含量減少。Stijn等[9]發(fā)現(xiàn)氮源濃度增加會導致醛脫氫酶活性增加，從而提高了辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯等乙基酯類的含量，這與本實驗研究結果一致。本實驗還發(fā)現(xiàn)提高氮源質量濃度不利于萜烯類物質的合成，這可能是因為在乙醇發(fā)酵過程中，部分葡萄糖經(jīng)糖酵解等多步酶促反應生成的乙酰CoA可參與多種物質合成，如進入三羧酸循環(huán)參與高級醇的合成，或直接用于合成脂肪酸或高級酯，還有一部分乙酰CoA進入甲羥戊酸途徑，參與萜烯類物質的合成，當大量的乙酰CoA進入酯類物質合成途徑時，進入甲羥戊酸途徑的CoA通量減少，最終可能導致萜烯物質合成減少[27]。

溫度是目前研究最多的影響發(fā)酵進行的因素，大量研究表明，低溫發(fā)酵有利于香氣品質的提升，這主要歸因于萜烯類物質的積累以及C6～C10中鏈高級酯含量的增加[18]。Beltran等[29]在釀酒酵母轉錄組分析中發(fā)現(xiàn)，當發(fā)酵溫度從10 ℃升高到30 ℃時，酵母細胞內(nèi)與氨基酸代謝相關基因的表達量下調(diào)，這會造成α-酮酸大量積累，進而生成更多的高級醇，但本實驗發(fā)現(xiàn)高級醇含量并非始終與發(fā)酵溫度呈正相關，當發(fā)酵溫度超過23 ℃時，高級醇含量隨發(fā)酵溫度的升高而降低，這可能是因為隨著發(fā)酵溫度的持續(xù)升高，參與高級醇合成的部分酶偏離了其最適反應溫度，從而使高級醇合成減少。Molina等[30]研究表明較高的發(fā)酵溫度會降低揮發(fā)性酯類化合物的穩(wěn)定性，增加蒸發(fā)損失，進而減少酯類香氣物質的積累。但也有研究指出，高溫導致蒸發(fā)損失增加并非酯類物質香氣減少的主要原因，而是因為在每個溫度條件下酯類物質的代謝活性與基因表達的差異所致[31]。一般來說，溫度越高，酵母發(fā)酵速度越快，發(fā)酵所需時間減少，醇類、酸類物質大量合成，酯類、萜烯類等復雜的香氣物質合成減少，本實驗也得到了與此類似的結果。

釀酒酵母菌株在偏中性或微酸條件下發(fā)酵能力最強，低pH值條件下酵母菌株可代謝產(chǎn)生更多的揮發(fā)酸，并且高級酯降解速度也會加快[32]，因此低pH值條件下模擬汁中大量的高級醇和酸類物質可能來自高級酯的降解作用；隨著pH值水平的升高，高級酯降解速度減緩，酯類、萜烯類物質合成途徑的相關酶活性提高，可積累大量的酯類、萜烯類香氣物質，本實驗結果與此一致。實驗中發(fā)現(xiàn)隨著SO2添加量增加，萜烯類物質含量迅速減小，這可能是因為隨著SO2添加量的升高，其對酵母細胞的毒害作用增強，酵母細胞內(nèi)的部分代謝途徑發(fā)生明顯改變[12]，導致乙酰CoA在酵母細胞內(nèi)的分配方式發(fā)生變化，使進入甲羥戊酸途徑的乙酰CoA迅速減少，最終造成萜烯類物質合成減少；再者SO2的添加能增加模擬汁的酸度，可間接對發(fā)酵香氣產(chǎn)生影響。適量濃度的SO2具有提高乙醇體積分數(shù)，保持果香味的功能[19]，這與本實驗中高級醇、高級酯香氣含量增加的結果相符。

本實驗發(fā)現(xiàn)氮源質量濃度變化對乙酸酯和乙基酯的影響趨勢一致，而其他3 種發(fā)酵因素對乙酸酯和乙基酯影響趨勢相反；發(fā)酵溫度對直鏈高級醇與支鏈高級醇影響趨勢一致，而其他3 種發(fā)酵因素對直鏈高級醇與支鏈高級醇影響趨勢相反，并且隨著發(fā)酵溫度、pH值、SO2添加量4 種發(fā)酵因素的改變，支鏈高級醇和乙酸酯變化趨勢一致，這可能是因為經(jīng)Ehrlich途徑合成的支鏈高級醇充當了乙酸酯合成的底物，因而兩者變化趨勢一致[20,23]。目前關于發(fā)酵因素對各類發(fā)酵香氣物質合成影響的機理性研究報道較少，尤其是直鏈高級醇與支鏈高級醇、乙酸酯與乙基酯對同一發(fā)酵因素顯現(xiàn)出不同變化趨勢的研究鮮見報道，因而有待進一步探究。

4 結 論

本實驗結果表明，釀酒酵母菌種與氮源質量濃度、發(fā)酵溫度、pH值、SO2添加量等因素對發(fā)酵香氣的影響差異較大。實驗所選的5 株釀酒酵母中LA-FR菌株產(chǎn)酯類、萜烯類物質能力最強，產(chǎn)香性能優(yōu)于其他4 株酵母。此外，氮源質量濃度、發(fā)酵溫度、pH值、SO2添加量對發(fā)酵香氣影響的結果顯示，較低的氮源條件下發(fā)酵有利于萜烯類和醇類物質的生成，不利于酯類物質的積累，并且氮源對醇類和酯類香氣含量影響較大；選擇較低的發(fā)酵溫度有利于酯類、萜烯類物質積累，發(fā)酵溫度對酸類香氣物質含量影響較大；在較高pH值條件下發(fā)酵的模擬汁中酯類、萜烯類物質含量明顯增加，醇類、酸類物質含量減少；SO2添加量與醇類、酯類合成量呈正相關，與酸類、萜烯類合成量呈負相關，且SO2的添加量對萜烯類香氣含量影響較大。

在發(fā)酵過程中，同一發(fā)酵因素對不同種類香氣物質的影響不同，且不同發(fā)酵因素對同一種類香氣物質的影響也不相同，所以在實際生產(chǎn)過程中，發(fā)酵香氣的調(diào)控應考慮多個因素，并且不同因素間可能還會存在交互作用，因此，本實驗所得結果可為葡萄酒香氣風味調(diào)控以及深入研究復合因素作用對發(fā)酵香氣的影響提供理論支持。