陳文哲，劉雪瑩，郭勝男，孫 涵，竇德強(qiáng)，蔡德成

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連116600； 2.大連五舟神草健康科技有限公司，遼寧大連116600）

孔雀草，俗稱臭菊花、緞子花，又稱法國萬壽菊，為菊科萬壽菊屬植物孔雀草（Tagetes patulaL.），以全草入藥。味苦，性涼。具清熱利濕、潤肺止咳之效［1］?？兹覆菔俏覈褡逅?，彝族藥名依尼補(bǔ)此烏，以花或根入藥，主治蛇咬傷、熱咳喘及頭暈頭昏等癥，此外還可以治療上呼吸道感染、痢疾、百日咳、牙痛、風(fēng)火眼痛，外用治療腮腺炎、乳腺炎等疾?。?］。在阿根廷孔雀草提取物內(nèi)服可作利尿劑使用［3］。此外還有研究發(fā)現(xiàn)其精油具有抗真菌活性，能夠有效治療植物的念珠菌病和真菌感染［4-6］。目前對于孔雀草的研究多集中于園林植物用于殺菌驅(qū)蟲，為進(jìn)一步利用孔雀草的藥用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)通過研究孔雀草水煎液及其組分的抗炎作用以確定其活性組分，并利用HPLC法分析孔雀草水煎液及其組分中主要成分，為孔雀草藥用價(jià)值的合理開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 KM小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，雄性，6～8 w齡，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供（許可證號：SCXK（遼）2015-0001）。

1.1.2 儀器 RE-85Z型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）；HH-S型電熱恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；TDZ4-WS低速臺式離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；KQ-250DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；可調(diào)式移液器（美國RAININ（瑞寧）公司）；UV-2100紫外分光光度計(jì)（上海UNICO公司）；FA-1004電子天平（上海精科天平廠）；1 mL精密注射器（上海正邦醫(yī)療科技有限公司）；打孔器（8 mm）；小鼠固定器（自制）；FD-EA-50冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（真空脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器）（美國安捷倫科技有限公司）；Acculab型萬分之一分析天平（德國 Sartorius group）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 二甲苯（天津市百世化工有限公司，批號：20070416）；伊文思藍(lán)（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：M0507A）；阿司匹林腸溶片（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：160419503）；TNF-α ELISA試劑盒（沈陽天和海生物試劑，批號：201608）；IL-6 ELISA試劑盒（沈陽天和海生物試劑，批號：201608）；孔雀草對照品（萬壽菊素、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-木糖苷、萬壽菊素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷）均為本實(shí)驗(yàn)室分離自制；丙酮、乙醚與無水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）均為分析純。甲醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）和乙腈（Oceanpak Alexative Chemical），均為色譜純。

1.1.4 供試藥物及其制備 孔雀草，由五舟現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展（大連）有限公司提供，并由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為菊科萬壽菊屬植物孔雀草的莖葉。將藥材用鐵研船粉碎，得粗粉。

稱取150 g孔雀草粗粉，第1次加10倍量水，浸潤4 h，文火煎煮提取1 h，靜置冷卻后，水煎液用200目濾布過濾，濾渣加8倍量水，文火再次煎煮1 h，水煎液靜置放涼后，濾布過濾，合并兩次水煎液濾液，3 000 r/min離心10 min，除去沉淀，上清液減壓濃縮回收溶劑，剩余少量溶劑，置低溫冷凍干燥機(jī)凍干，計(jì)算收率（結(jié)果見表1）。臨用前按照收率取適量0.5%CMC-Na配制成100 g/L（以生藥計(jì)）溶液。置冰箱中-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

稱取1 kg孔雀草粗粉，第1次加10倍量水，浸漬4 h，文火煎煮提取1 h，同時(shí)提取揮發(fā)油；靜置冷卻后，水煎液用200目濾布過濾，濾渣加8倍量水，文火再次煎煮1 h，同時(shí)提取揮發(fā)油，水煎液靜置放涼后，濾布過濾，合并兩次水煎液濾液，將合并后的水煎液沉降離心濃縮至1.5 L。調(diào)節(jié)乙醇濃度至70%，醇沉2次，將醇沉組分與上清液組分各自合并，65℃嚴(yán)格控溫，減壓回收溶劑，剩余少量溶劑，置低溫冷凍干燥機(jī)凍干，計(jì)算收率（結(jié)果見表1）。臨用前按照收率取適量0.5%CMC-Na配制成100 g/L（以生藥計(jì)）溶液。置冰箱中-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 孔雀草各組分收率表

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 分組與給藥 將70只小鼠按體重隨機(jī)分為空白組（CO）、模型組（MO）、陽性對照組（PO，阿司匹林0.20 g/kg）、孔雀草水煎液組（WD，2.50 g/kg）、孔雀草醇沉組分組（AP，0.35 g/kg），孔雀草上清液組分組（SU，0.29 g/kg）、孔雀草揮發(fā)油組分組（VO，0.75 mg/kg）7組，每組10只。各給藥組均給與相應(yīng)藥物，空白組與模型組給予同體積0.5%CMC-Na，給藥體積 0.5 mL/20 g，連續(xù)灌胃 7 d，各組灌胃時(shí)間為09：00。

1.2.1.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 各組動物末次給藥30 min后尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)0.2 mL/20 g。立即在小鼠右耳前后涂抹二甲苯共20 μL，30 min后將小鼠處死，沿耳廓剪下左、右兩耳片，用8 mm打孔器分別在同一部位打下圓耳片，用電子天平精密稱定兩耳片重量，計(jì)算腫脹度，并比較各組間腫脹度及腫脹抑制率的差異［8］。腫脹度為致炎右耳重量與未致炎左耳重量之差。

其中A為腫脹抑制率，B為模型組平均腫脹度，C為給藥組平均腫脹度。

二甲苯致炎30 min后摘眼球取血至失血死亡，3 000 r/min離心 10 min，取上清，EILSA法檢測血清 IL-6 與 TNF-α 含量［9-11］。

1.2.2 小鼠毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn) 待1.2.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將左、右耳片剪碎，放入4 mL 35%丙酮水溶液中，37℃浸泡48 h后，3 000 r/min離心15 min，上清液于UV-2100紫外分光光度計(jì)611 nm下測定吸光度，并比較各實(shí)驗(yàn)組與對照組吸光度值［7］。

1.2.3 孔雀草化學(xué)成分HPLC分析

1.2.3.1 樣品制備 對照品溶液的制備：分別取適量萬壽菊素、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-木糖苷、萬壽菊素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷溶于純甲醇中，超聲至全溶，0.45 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

孔雀草樣品溶液的制備：①孔雀草水煎液樣品溶液：取24.23 mg孔雀草水煎液凍干粉于10 mL容量瓶中，60%甲醇定容至刻度，搖勻，制備成濃度為0.1 g/mL（以生藥計(jì)）的供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。②孔雀草上清液組分樣品溶液：取11.53 mg孔雀草上清組分凍干粉于10 mL容量瓶中，60%甲醇定容至刻度，搖勻，制備成濃度為0.1 g/mL（以生藥計(jì)）的供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。③孔雀草揮發(fā)油組分樣品溶液：取3 μL孔雀草揮發(fā)油組分于10 mL容量瓶中，純甲醇定容至刻度，搖勻，制備成濃度為0.1 g/mL（以生藥計(jì)）的供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6×150 mm，5 μm）；檢測器為二極管陣列檢測器（DAD）；以乙腈（C）-磷酸水（D）為流動相梯度洗脫，0～18 min（16%C），18～30 min（16%C-52%C），30～35 min（52%C），35～50 min（52%C ～80%C），50～60 min（80%C）；流速 1.0 mL/min；柱溫 28 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：254 nm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)首先采用Q檢驗(yàn)，剔除潛在的離群值，然后采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 二甲苯致小鼠耳腫脹腫脹度比較 小鼠右耳涂抹二甲苯后，與空白組比較，模型組的腫脹度明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，孔雀草上清液組、阿司匹林組、孔雀草水煎液組及孔雀草揮發(fā)油組分能顯著降低二甲苯致小鼠耳腫脹模型腫脹度（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表 2。

表2 各組小鼠耳腫脹腫脹度比較 （±s）

表2 各組小鼠耳腫脹腫脹度比較 （±s）

注：與 CO 組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與 MO 組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01

?

2.1.2 對二甲苯致小鼠耳腫脹毛細(xì)血管通透性的影響 與空白組比較，模型組小鼠耳廓伊文思藍(lán)染料滲出的吸光度值顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，阿司匹林組、孔雀草水煎液組及各組分均能顯著降低小鼠耳廓伊文思藍(lán)染料滲出的吸光度值（P＜0.01）。結(jié)果見表 3。

表3 不同組間小鼠耳腫脹毛細(xì)血管通透性比較 （±s）

表3 不同組間小鼠耳腫脹毛細(xì)血管通透性比較 （±s）

注：與 CO 組比較，1）P＜0.01；與 MO 模型組比較，2）P＜0.01

?

2.1.3 對血清中IL-6與TNF-α含量影響 與空白組相比，模型組小鼠血清IL-6與TNF-α含量均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，阿司匹林組、孔雀草水煎液組、孔雀草揮發(fā)油組及上清液組對二甲苯所致的急性小鼠耳腫脹血清炎癥因子均有不同程度的抑制作用（P＜0.01）。結(jié)果見圖1、圖2。

2.2 HPLC分析結(jié)果

按供試品洗脫條件進(jìn)樣，得到孔雀草各對照品的保留時(shí)間（tR，結(jié)果見表4），與孔雀草樣品色譜圖比對識別其對照品色譜峰所代表的化學(xué)成分信息。與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比對，孔雀草水煎液與上清液組分的HPLC-DAD圖譜均可確定8個(gè)峰（結(jié)果見圖3），分別為：1萬壽菊素；2槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷；3槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷；4山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷；5山奈酚-3-O-β-D-木糖苷；6 山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷；7山奈酚；8山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷。而孔雀草揮發(fā)油HPLC-DAD圖譜中并無對照品存在。

圖1 各組小鼠血清中IL-6含量比較

圖2各組小鼠血清中TNF-α含量比較

表4 對照品保留時(shí)間

3 討論

炎癥是機(jī)體對于刺激的一種防御反應(yīng)，任何能夠引起組織損傷的因素都可成為炎癥的原因。炎癥的基本病理變化通常概括為局部組織的變質(zhì)、滲出和增生［12-13］。由二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥模型為急性炎癥模型，急性炎癥是機(jī)體對致炎因子的刺激所發(fā)生的立即和早期反應(yīng)。炎性滲出是急性炎癥的重要特征，炎癥過程中參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的化學(xué)因子即炎癥介質(zhì)，有外源性和內(nèi)源性兩大類。TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子為內(nèi)源性炎癥介質(zhì)。TNF-α是來源于單核巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)黏附分子在上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的表達(dá)，誘導(dǎo)趨化因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向炎癥局部聚集［2］。IL-6作為促炎細(xì)胞因子由活化的肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有放大炎癥反應(yīng)、促進(jìn)急性時(shí)相反應(yīng)物質(zhì)產(chǎn)生趨化因子等作用［14］。

圖3 孔雀草樣品HPLC-DAD圖譜

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠的耳腫脹度、毛細(xì)血管通透性、血清中細(xì)胞因子TNF-α，IL-6含量與空白組相比明顯升高，表明造模成功。而與模型組比較，孔雀草水煎液組、孔雀草揮發(fā)油組和孔雀草上清液組小鼠的耳腫脹度、毛細(xì)血管通透性、血清中細(xì)胞因子TNF-α，IL-6含量明顯降低。這表明孔雀草水煎液、揮發(fā)油及上清液中含有的成分具有一定的抗炎作用。

孔雀草揮發(fā)油的組成十分復(fù)雜，其主要成分為2-蒈烯和 β-水芹烯，約占 70%，而其他約 30%［15］，中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為揮發(fā)油通常具有發(fā)散解表、芳香開竅、理氣止痛、清熱解毒、殺蟲抗菌等作用，現(xiàn)代研究表明揮發(fā)油具有祛痰、止咳、平喘、驅(qū)風(fēng)、解熱鎮(zhèn)痛及抗菌消炎等作用［16-17］。本實(shí)驗(yàn)通過孔雀草中單體化合物為對照品，利用對照品與樣品保留時(shí)間對孔雀草及其組分的HPLC色譜峰進(jìn)行定性分析，發(fā)現(xiàn)孔雀草莖葉水煎液與上清液組分中主要含有萬壽菊素、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷等黃酮類成分化合物，黃酮類化合物通常具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用［18-19］。故可以認(rèn)為孔雀草水煎液發(fā)揮抗炎活性主要在于其揮發(fā)油組分與上清液組分中的總黃酮成分。

本實(shí)驗(yàn)通過對孔雀草抗炎活性研究，初步確定了孔雀草的抗炎活性物質(zhì)為孔雀草揮發(fā)油與總黃酮成分，為孔雀草藥用價(jià)值的深入研究和開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。