胡安東，賀欣薇，楊 霞，張 飄，程振濤,3，姜海波,3，文明,3

（1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴陽 550025；3.貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴陽 550025）

貴州省淡水資源豐富，漁業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)不斷優(yōu)化，漁業(yè)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大。資料顯示，貴州水產(chǎn)養(yǎng)殖面積從2010年2.93萬公頃提高至2018年的7.48萬公頃，年均增長率達18%。但隨著漁業(yè)生產(chǎn)方式由小規(guī)模家庭經(jīng)營向適度規(guī)模經(jīng)營快速轉(zhuǎn)變、水生動物養(yǎng)殖品種增加與遠距離流通、出入境經(jīng)營水生動物產(chǎn)品規(guī)模和人員數(shù)量大幅度增長等，導致目前我省魚類養(yǎng)殖場疫病時有發(fā)生。

鯉魚（cyprinus carpio）是我國重要淡水魚類[1]，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，能提供人體必需的氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素A和維生素D等，深受廣大消費者喜愛，是貴州省少數(shù)民族地區(qū)稻田飼養(yǎng)的主要經(jīng)濟淡水魚種。在擴大鯉魚養(yǎng)殖過程中，常出現(xiàn)一些細菌性疾?。ㄈ缂毦誀€鰓病、豎鱗病和細菌性腸炎病等）、病毒性疾?。ㄈ珲幇捳畈《静?、鯉春病毒血癥和鯉浮腫病）和寄生蟲?。ㄈ畿囕喯x病、指環(huán)蟲病和長棘吻蟲病等），常造成巨大經(jīng)濟損失。

2018年10月，貴州省從江縣某鯉養(yǎng)殖專業(yè)合作社飼養(yǎng)的幼齡鯉魚爆發(fā)大批量發(fā)病死亡現(xiàn)象，病鯉主要表現(xiàn)為游動緩慢、飲食減退、體表出血、鰓部潰爛、急性死亡等。本實驗室通過流行病學調(diào)查、解剖病變觀察、寄生蟲檢查、細菌分離鑒定和病毒PCR檢測，確診該次鯉魚爆發(fā)死亡病例為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和鯉浮腫病毒（Carp edema virus，CEV）混合感染所致，其中稻田養(yǎng)殖鯉魚CEV感染為貴州省首次報道，現(xiàn)將本次病例驗室診斷結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料病鯉，為從江縣某鯉養(yǎng)殖專業(yè)合作社送檢，體長約7～13 cm，重量約6～53 g；健康鯉，購自貴陽市花溪水產(chǎn)品貿(mào)易市場。鮮血瓊脂平板與腦心浸液液體培養(yǎng)基，由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室自制；細菌生化鑒定管和細菌藥敏片，購自杭州微生物試劑有限公司；HE染色試劑盒、細菌基因組提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；DNA回收試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；病毒核酸提取試劑盒，購自TAKARA公司；其他試劑均為分析純。

1.2 流行病學調(diào)查按照動物疫病調(diào)查方法進行該鯉爆發(fā)死亡病例的流行病學調(diào)查。

1.3 剖解病變觀察取送檢病鯉，剖解觀察大體病變后，采集鰓、腎臟、脾臟、肝臟、腸等組織，固定，石蠟包埋，制作石蠟切片，HE染色并觀察。

1.4 寄生蟲檢查取病鯉體表、鰓絲和其他內(nèi)臟組織等進行壓片，光學顯微鏡觀察寄生蟲感染情況。

1.5 細菌分離鑒定

1.5.1 細菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學鑒定 無菌采集病鯉病變組織，劃線接種于鮮血瓊脂平板，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單個優(yōu)勢菌落純化培養(yǎng)后進行革蘭氏染色鏡檢，同時用腦心浸液液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 分離菌生理生化特性鑒定 挑取分離菌純培養(yǎng)物，接種微量生化鑒定管，28℃恒溫培養(yǎng)24～48 h觀察結(jié)果，參照文獻[2]進行結(jié)果判定。

1.5.3 分離菌16S rRNA基因測序鑒定 提取分離菌基因組，以細菌16S rRNA基因通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，預期擴增長度1500 bp）進行PCR擴增。反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s、55℃退火45 s、72℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。取PCR產(chǎn)物進行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物，送至生工生物（上海）股份有限公司測序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對分析，MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5.4 分離菌藥敏試驗 采用紙片擴散法（K-B法），即取分離菌純培養(yǎng)物100 μL菌液，均勻涂布于腦心浸液瓊脂平板，粘貼藥敏紙片，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并記錄抑菌圈直徑，判定結(jié)果。

1.6 病毒PCR檢測

1.6.1 鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）檢測 參照文獻[3]，設(shè)計合成KHVSph基因特異性引物（表1）。取病鯉病變組織器官，混勻研磨，提取核酸樣本為模板進行PCR檢測，反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)程序：94℃ 預變性5 min；94℃變性30 s、54℃退火45 s、72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72℃終延伸5 min。取PCR產(chǎn)物進行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.6.2 鯉春病毒血癥病毒（Spring viremia of carp virus，SVCV）檢測 參照文獻[4]，設(shè)計合成SVCV2對特異性引物（表1）。取上述提取的核酸樣本，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行PCR檢測，反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)程序：94℃預變性4 min；95℃變性45 s、55℃退火45 s、72℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。取PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

表1 本研究引物序列Table 1 Primer sequences in this study

1.6.3 鯉浮腫病毒（CEV）檢測 參照文獻[5]，設(shè)計合成CEV外膜蛋白基因特異性引物（表1）。取上述提取的核酸樣本為模板進行兩步PCR檢測，反應(yīng)體系均為25 μL。第一步PCR檢測的反應(yīng)程序：94℃預變性2 min，94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸50 s，共35個循環(huán)；72℃終延伸5 min；第二步PCR檢測是以第一步PCR產(chǎn)物為模板，反應(yīng)程序：94℃預變性3 min；94℃變性20 s、58℃退火20 s、72℃延伸20 s，共35個循環(huán)；72℃終延伸5 min。取PCR產(chǎn)物進行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.7 人工感染試驗取病鯉組織器官，按1:5（重量體積比）加入無菌生理鹽水，研磨勻漿后反復凍融3次，以7000×g離心20 min，收集含有病毒的上清，過濾除菌后備用；取分離菌純培養(yǎng)物，用無菌生理鹽水制成濃度為2×108CFU/mL的細菌懸液。取健康鯉，隨機分為3組即病毒組、細菌組和對照組，每組10尾；病毒組每尾腹腔注射0.2 mL病毒懸液，細菌組每尾腹腔注射0.2 mL細菌懸液，對照組每尾腹腔注射0.2 mL無菌生理鹽水；注射后于25℃水箱中飼養(yǎng)，連續(xù)觀察10 d，每天觀察試驗鯉發(fā)病情況，統(tǒng)計死亡率，并及時對死亡鯉進行剖檢并檢測其病原體。

2 結(jié)果

2.1 流行病學調(diào)查結(jié)果貴州省從江縣某鯉養(yǎng)殖專業(yè)合作社為充分利用稻田水土資源，以稻田養(yǎng)魚為主要養(yǎng)殖模式，一直以來穩(wěn)糧增收，成效顯著。于2018年10月合作社新引進一批鯉魚苗，按照往常的魚苗投放流程進行投放，但投放后不久魚苗開始出現(xiàn)游動緩慢、不進食、體表出血、爛鰓等臨床癥狀，該病情在魚苗中迅速擴散，隨即在1周內(nèi)魚苗出現(xiàn)大批量死亡。

2.2 剖解病變觀察結(jié)果對病鯉進行大體病變觀察發(fā)現(xiàn)，病鯉主要表現(xiàn)為鰓絲潰爛、眼球內(nèi)陷、體表出血和肛門紅腫等（圖1）；對制作好的病鯉組織切片進行組織病理觀察顯示，鰓板腫脹粘連及上皮細胞脫落、腎小球出血萎縮和腎小囊空腔增大等（圖2）。

圖1 病鯉主要癥狀Fig 1 Gross lesions in diseased carp

圖2 病鯉組織病理觀察Fig.2 Histopathological observation of diseased carp

2.3 寄生蟲檢查結(jié)果在光學顯微鏡下觀察制作好的病鯉體表、鰓絲和其他內(nèi)臟組織壓片均未發(fā)現(xiàn)任何寄生蟲，故排除寄生蟲感染。

2.4 細菌分離鑒定結(jié)果

2.4.1 細菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學鑒定結(jié)果 將病鯉內(nèi)臟組織在鮮血瓊脂平板上培養(yǎng)，可觀察到邊緣光滑、中央微隆起的圓形灰白色菌落，菌落周圍有β溶血環(huán)（圖3）；經(jīng)革蘭氏染色鏡檢可見單個或成對排列、兩端鈍圓的陰性短桿菌（圖4）。

圖3 分離菌株β溶血環(huán)Fig.3 β hemolysis of the isolated strain

圖 4 分離菌菌落形態(tài)Fig.4 Mycelium morphology of the isolates

2.4.2 分離菌生理生化特性鑒定結(jié)果 挑取分離菌純培養(yǎng)物，接種相應(yīng)的微量生化鑒定管，28℃恒溫培養(yǎng)24～48 h觀察結(jié)果并進行判定。結(jié)果顯示分離菌具有運動性，能利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，分解乳糖、麥芽糖，不分解脲素、半乳糖、纖維二塘，M-R試驗、V-P試驗、精氨酸雙水解酶和賴氨酸脫羧酶陽性，鳥氨酸脫羧酶和苯丙氨酸脫氨酶陰性（表2），符合嗜水氣單胞菌生理生化特征，初步判定該分離菌為嗜水氣單胞菌，并命名為G2-CJ株。

2.4.3 分離菌16S rRNA基因測序鑒定結(jié)果 通過細菌16S rRNA基因PCR擴增，將所得產(chǎn)物送樣測序并將結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對，選取同源性較高菌株16S rRNA基因序列并設(shè)置外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示分離菌株GZ-CJ與嗜水氣單胞菌聚為一個分支（圖5）。綜合分離菌株形態(tài)學特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析，判斷本次分離菌為嗜水氣單胞菌。

2.4.4 分離菌藥敏試驗結(jié)果 采用紙片擴散法對分離菌株進行藥物敏感性實驗。結(jié)果顯示，分離菌對頭孢曲松、呋喃唑酮、頭孢哌酮等5種藥物高度敏感，對慶大霉素、多西環(huán)素、頭孢呋辛等4種藥物中度敏感，對復方新諾明、磺胺異惡唑、羧芐西林等7種藥物耐藥（表3）。

表2 分離菌生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identi fication of isolated bacteria

圖5 分離菌GZ-CJ 16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of the isolates based on 16S rRNA gene fragment

表3 分離菌藥敏試驗結(jié)果Table 3 Antimicrobial susceptibility tests to the bacterial isolates

2.5 病毒PCR檢測結(jié)果

2.5.1 KHV與SVCV檢測結(jié)果 取病鯉病變組織器官，混勻研磨，提取核酸樣本為模板，用KHV與SVCV特異性引物進行PCR擴增檢測，將擴增產(chǎn)物在 1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳并用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，結(jié)果顯示病鯉樣本均未能擴增出KHV與SVCV特異性片段，說明病鯉未感染鯉皰疹病毒和鯉春病毒血癥病毒。

2.5.2 CEV檢測結(jié)果 將上述提取的病鯉核酸樣本，用CEV特異性引物進行巢式PCR擴增檢測，將擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳并用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，結(jié)果顯示病鯉樣本僅第二次PCR反應(yīng)擴增出182 bp特異性片段（圖6）。取巢式PCR陽性產(chǎn)物進行測序分析，結(jié)果表明，病鯉樣本核酸為鯉浮腫病毒核酸。與NCBI已提交的CEV MG550029株和MH250199株聚為一支（圖7），親緣關(guān)系最近。

2.6 人工感染試驗結(jié)果人工感染試驗發(fā)現(xiàn)，對照組鯉在觀察期內(nèi)無癥狀和死亡現(xiàn)象；病毒組于注射后第3 d，極少數(shù)鯉出現(xiàn)游動緩慢的癥狀，大部分鯉無臨床癥狀，第5 d出現(xiàn)死亡，10 d內(nèi)累積死亡率為20%，剖檢死亡鯉，發(fā)現(xiàn)僅鰓部腫脹，體表輕微出血，從死亡鯉中未分離到細菌，檢測CEV呈陽性；細菌組于注射后第12 h出現(xiàn)體表出血，肛門紅腫等癥狀，第1 d后開始死亡，第3 d達到死亡高峰，10 d內(nèi)累積死亡率為70%，剖檢死亡鯉，發(fā)現(xiàn)鰓部潰爛，肝臟、腎臟腫大等癥狀，從死亡鯉中再次分離到嗜水氣單胞菌，但未檢測到CEV。

圖6 病鯉CEV巢式PCR檢測結(jié)果Fig.6 Result of detecting CEV from the common carp by nested-PCR

圖7 基于CEV巢式PCR產(chǎn)物序列同源性系統(tǒng)進化分析結(jié)果Fig.7 Phylogenetic analysis of sequence homology of nested PCR products based on CEV

3 討論

本研究根據(jù)該水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社爆發(fā)性死亡鯉的流行病學調(diào)查，病理學觀察結(jié)果，寄生蟲學、細菌學及病毒學鑒定結(jié)果，診斷鯉爆發(fā)性死亡原因為致病性嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和鯉浮腫病毒（CEV）混合感染所致。

細菌感染一般可導致多種魚類發(fā)病并可在全年流行，溫度較低時發(fā)病率下降。嗜水氣單胞菌是弧菌科氣單胞菌屬的革蘭氏陰性短桿菌，極端單鞭毛，沒有芽孢和莢膜，廣泛分布于自然界中，是多種動物以及人的條件致病菌[6-10]。不同魚類感染嗜水氣單胞菌所表現(xiàn)出的癥狀略有不同，但主要以組織充血、出血，爛鰓等癥狀為主。感染嗜水氣單胞菌的西伯利亞鱘[11]主要表現(xiàn)為吻部充血，鰓出血，肝臟發(fā)白，腸道末端充血和出血；感染嗜水氣單胞菌的大菱鲆[12]主要表現(xiàn)為口部和鰭基部出血，體色發(fā)黑，腹部膨脹；感染嗜水氣單胞菌的美洲紅點鮭[13]表現(xiàn)為鰓絲腫脹且末端糜爛呈灰褐色，后腸充血，腸壁黏膜呈紫紅色；本研究中病鯉表現(xiàn)為鰓絲潰爛，體表出血，肛門紅腫等癥狀，與其他魚類感染嗜水氣單胞菌的病癥相似。

病毒感染是導致魚類疾病發(fā)病率和死亡率高的原因。CEV是痘病毒科的線性雙鏈DNA病毒，有桑葚似囊膜，病毒粒子直徑約為250 nm。有關(guān)于鯉感染CEV出現(xiàn)的病癥，有不同報道，多數(shù)為眼凹陷、爛鰓、體表潰爛、昏睡等癥狀，但也有報道稱沒有臨床癥狀和死亡現(xiàn)象。劉群等[14]研究發(fā)現(xiàn)鯉感染CEV表現(xiàn)為體色發(fā)黑、顱骨軟組織周圍皺縮、眼凹陷、鰓粘臟等癥狀且出現(xiàn)大量死亡；王小亮等[15]研究發(fā)現(xiàn)一些鯉感染CEV，并未表現(xiàn)出臨床癥狀和大量死亡現(xiàn)象；本研究結(jié)果表明，CEV對鯉致死率并不高，部分未死亡鯉也無臨床癥狀，與Matras等[16]和Adamek等[17]研究結(jié)果一致。推測鯉感染CEV不一定爆發(fā)鯉浮腫病，有關(guān)于CEV誘導疾病出現(xiàn)的臨床病癥，可能是由其他因素引起，在沒有外界條件刺激的情況下，鯉感染CEV不一定發(fā)病和死亡。

CEV感染鯉與KHV感染具有相似癥狀，因此僅靠臨床癥狀并不能進行直接判斷，還需通過實驗室方法進行鑒別診斷?，F(xiàn)階段研究人員對CEV的了解并不是十分深入，沒有發(fā)現(xiàn)該病毒的易感細胞系[18]，不了解其基因組結(jié)構(gòu)和編碼蛋白功能，這對病毒的分離純化、檢測技術(shù)的優(yōu)化和防治方法的建立造成了嚴重阻礙。張文等[19]建立了雙重實時熒光定量PCR方法用于CEV檢測，該方法靈敏度好、特異性高，適用于實驗室常規(guī)檢測；曹歡等[20]建立了LAMP方法用于CEV檢測，該方法操作簡單、特異性好、靈敏度高，可直觀觀察出反應(yīng)結(jié)果，適用于在養(yǎng)殖現(xiàn)場快速檢測；Soliman等[21]建立了RPA分析和量油尺方法用于CEV檢測，該方法只需要50 min測試樣品，除加熱塊以外不需要任何設(shè)備以提供恒定溫度，適用于監(jiān)測進口或出口鯉的貿(mào)易以控制病毒的傳播。本研究采用Oyamatsu等[5]建立的nest-PCR方法從病鯉中檢測出CEV，該方法在很長一段時間對CEV檢測發(fā)揮了重要作用。期望未來科研工作者對CEV有更多深入研究，建立出CEV更加便捷、準確的檢測方法，為CEV的防治做出貢獻。

當魚同時或繼發(fā)感染2種及2種以上病原時稱為混合感染，Kotob等[22]將魚類混合感染分為同類病原混合感染和異類病原混合感染，病原之間的作用或為協(xié)同或為拮抗。魚類在混合感染過程中對不同病原體的敏感性會發(fā)生變化，可以改變不同魚類疾病病程和嚴重性，且大多起到協(xié)同致病作用，導致魚類爆發(fā)性死亡。本研究對該養(yǎng)殖基地鯉爆發(fā)性死亡進行了實驗室診斷，分析其發(fā)病情況以及結(jié)合本試驗研究結(jié)果，推測導致該養(yǎng)殖基地鯉爆發(fā)性死亡的原因為致病性嗜水氣單胞菌和鯉浮腫病毒混合感染，這2種病原混合感染加快了鯉發(fā)病病程及死亡速度。建議水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社在引進苗種時進行隔離檢疫，在飼養(yǎng)過程中提高養(yǎng)殖人員的養(yǎng)殖技術(shù)和管理水平，維護良好的養(yǎng)殖環(huán)境，以減少魚體應(yīng)激，發(fā)病后應(yīng)選擇敏感性藥物（頭孢曲松、頭孢哌酮、呋喃唑酮等）進行治療，以輪換用藥方式給藥以防止耐藥菌株的產(chǎn)生，并用0.5%鹽水浸泡病魚，以緩解死亡。