柴淑梅 ，張 倩 ，翟 頎 ，余新剛 ，洪 煬 ，陸 珂 ，李 浩 ，林矯矯 ，柏熊 ，謝建蕓，傅志強(qiáng)

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203）

日本血吸蟲(chóng)?。╯chistosomiasis japonicum）是一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病。日本血吸蟲(chóng)（Schistosoma japonicum，S. japonicum）是該病病原，可寄生于7屬41種哺乳動(dòng)物，不同種類的宿主對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染的適宜性差異較大[1]。根據(jù)血吸蟲(chóng)在感染宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育情況，可將宿主分為適宜宿主和非適宜宿主。東方田鼠（Microtus fortis，M.fortis）是我國(guó)迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種具有天然抗日本血吸蟲(chóng)病特征的哺乳動(dòng)物。日本血吸蟲(chóng)在東方田鼠體內(nèi)先后經(jīng)歷皮膚期童蟲(chóng)、肺期童蟲(chóng)及肝期童蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程，最終在肝臟消亡[2]。多位學(xué)者從血清、組織蛋白質(zhì)組學(xué)和差異基因等多個(gè)途徑研究了東方田鼠與其他宿主之間差異，然而東方田鼠天然抗日本血吸蟲(chóng)的機(jī)制仍然是一個(gè)未解之謎[3-4]。

血吸蟲(chóng)尾蚴侵入終末宿主皮膚后通過(guò)毛細(xì)血管和毛細(xì)淋巴管進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，此后在其中生長(zhǎng)發(fā)育。血液不僅為蟲(chóng)體生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是宿主對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要環(huán)境，因此分析血液中的免疫細(xì)胞和生化物質(zhì)是了解宿主和血吸蟲(chóng)相互作用的重要途徑。邵偉娟等[5-6]測(cè)定了東方田鼠正常生理狀態(tài)下的血液和生化血清指標(biāo)，結(jié)果顯示部分指標(biāo)與小鼠有差異。本研究比較分析了BALB/c鼠、東方田鼠未感染和感染日本血吸蟲(chóng)后不同時(shí)間點(diǎn)的血常規(guī)和生化各項(xiàng)指標(biāo)變化情況。

1 材料與方法

1.1 生物材料清潔級(jí)東方田鼠長(zhǎng)江亞種（70 g，雄性）由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供；BALB/c鼠（25 g，雄性）購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株尾蚴由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物血吸蟲(chóng)病研究室提供。

1.2 主要儀器血細(xì)胞分析儀（邁瑞B(yǎng)C5300），生化分析儀（邁瑞B(yǎng)S200），TOMY全自動(dòng)高壓滅菌鍋（SX-500，日本TOMY公司），純水/超純水一體化系統(tǒng)（Millipore公司）。

1.3 血常規(guī)檢測(cè)東方田鼠、BALB/c鼠各20只，分別腹部攻擊感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴100條，并在感染后第0、1、3、5、8、12、16、21、28、35、42 d進(jìn)行尾部毛細(xì)管采血 20 μL。將采集血液迅速轉(zhuǎn)移到含180 μL稀釋液的1.5 mL離心管中吹打混勻，放置2 min 后采用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)包括：白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、嗜中性粒細(xì)胞（neutrophils，Neu）、淋巴細(xì)胞（lymphocyte，Lym）、單核細(xì)胞（monocytes，Mon）、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，Eos）、嗜堿性粒細(xì)胞（basophil，Bas）、紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、血細(xì)胞壓積（packcd cell volume，HCT）、紅細(xì)胞平均容量（mean corpuscular volume，MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白容量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、紅細(xì)胞平均血細(xì)胞濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）和血小板計(jì)數(shù)（platelet，PLT）。所有樣本均在2 h內(nèi)檢測(cè)完畢。

1.4 血清生化檢測(cè)東方田鼠、BALB/c鼠各40只，分別腹部攻擊感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴100條，并在感染后第0、1、3、5、8、12、16、21、28、35、42 d進(jìn)行摘眼球采血并處死。全血室溫下靜置30 min，4℃靜置30 min，400×g離心15 min，收集血清-20℃保存?zhèn)溆谩Ｉ笜?biāo)包括總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、前白蛋白（prealbumin，PA）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、載脂蛋白A1（apolipoproteinⅠ，ApoA1）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）、補(bǔ)體C3 （complement C3）和補(bǔ)體C4（complement C4）等。

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞變化血常規(guī)檢測(cè)東方田鼠感染血吸蟲(chóng)前后血細(xì)胞含量及其變化（表1）發(fā)現(xiàn)，東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴后第1～16 d期間WBC、Neu、Lym、Mon、Eos、Bas等顯著高于感染前（0 d），BALB/c鼠感染后血象變化稍有差異，但不顯著（表2）。比較小鼠與東方田鼠的白細(xì)胞分類含量及其變化發(fā)現(xiàn)，東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴第1～16 d 期間WBC顯著高于正常值，主要原因是Neu的顯著升高；而小鼠感染血吸蟲(chóng)后WBC數(shù)量升高，但只有第5、16 d顯著高于感染前（0 d），且在正常參考值之內(nèi)，可能與Eos和Lym的升高相關(guān)（圖1）。

圖1 東方田鼠、BALB/c鼠感染日本血吸蟲(chóng)后白細(xì)胞及分類細(xì)胞變化趨勢(shì)Fig.1 The dynamic changes of white blood cell and its classi fication from S. japonicum-infected Microtus fortis and BALB/c mouse

表1 東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)前后血細(xì)胞指標(biāo)Table 1 Blood cell indexes of Microtus fortis before and after infection of Schistosoma japonicum

表2 BALB/c 小鼠感染日本血吸蟲(chóng)前后血細(xì)胞指標(biāo)Table 2 Blood cell indexes of BALB/c mice befor e and after infection of Schistosoma japonicum

2.2 血清生化變化東方田鼠、BALB/c鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴前后血清生化指標(biāo)含量及其結(jié)果見(jiàn)表3～4。東方田鼠感染后ALB、HDL-C顯著升高，BALB/c鼠IgG、IgM在感染后第4周顯著升高，其他指標(biāo)變化不顯著。比較東方田鼠和小鼠的各指標(biāo)結(jié)果表明，東方田鼠血清TP、LDL-C、ApoA1、PA含量高于小鼠，IgM、HDL-C含量低于小鼠（圖2）。

表3 東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)前后血清生化指標(biāo)Table 3 Blood biochemical indexes of Microtus fortis before and after infection of Schistosoma j

表4 BALB/c 小鼠感染日本血吸蟲(chóng)前后血清生化指標(biāo)Table 4 Blood biochemical indexes of BALB/c mice befor e and after infection of Schistosoma japonicum

3 討論

日本血吸蟲(chóng)可自然寄生于40多種哺乳動(dòng)物，唯獨(dú)不能在東方田鼠中發(fā)育成熟，這一獨(dú)特的生物學(xué)現(xiàn)象及抗性機(jī)制引起了廣泛關(guān)注。宿主和寄生蟲(chóng)的相互作用是寄生蟲(chóng)能否完成生活史和宿主發(fā)病情況的重要因素[7]。東方田鼠對(duì)日本血吸蟲(chóng)的抗性為研究宿主殺傷血吸蟲(chóng)，控制和限制感染的宿主-寄生蟲(chóng)相互作用提供了良好的模型系統(tǒng)。血吸蟲(chóng)尾蚴侵入東方田鼠皮膚后進(jìn)入其循環(huán)系統(tǒng)，血液是血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)賴以生存攝取營(yíng)養(yǎng)的主要環(huán)境，其中的細(xì)胞和生化物質(zhì)可能是其抵抗感染的重要因素，因此分析東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴后血細(xì)胞和生化物質(zhì)的含量及其變化可為抗性機(jī)制的研究提供線索。

天然免疫細(xì)胞是參與先天性免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞統(tǒng)稱，包括吞噬細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等）和非吞噬性先天性免疫細(xì)胞（NK、NKT等）。這些細(xì)胞在先天性免疫應(yīng)答中起重要作用，也可通過(guò)分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[8-9]。蔣偉斌等[10]表明，東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)后第3～16 d血液嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化性和粗大的嗜酸性顆粒，顆粒內(nèi)含有過(guò)氧化物酶和酸性磷酸酶，能有效的殺滅寄生蟲(chóng)，劉金明等[11]發(fā)現(xiàn)東方田鼠EOS能粘附在日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)表面，是否起到殺蟲(chóng)作用仍然未知。胡媛等[12]在東方田鼠免疫抑制模型中成功抑制了淋巴細(xì)胞的增值，但東方田鼠對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染的表型沒(méi)有改變，推測(cè)淋巴細(xì)胞在東方田鼠抗血吸蟲(chóng)病機(jī)制中可能不發(fā)揮直接作用。本研究分析比較了東方田鼠和BALB/c鼠感染日本血吸蟲(chóng)后血常規(guī)五分類的含量和動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明東方田鼠外周血中Neu的含量顯著大于BALB/c鼠的正常參考值，而且其變化趨勢(shì)與感染過(guò)程有一定的相關(guān)性。中性粒細(xì)胞具有變形運(yùn)動(dòng)和吞噬活動(dòng)的能力，細(xì)胞表面具有補(bǔ)體和免疫球蛋白受體，是機(jī)體對(duì)抗病原最重要的防衛(wèi)系統(tǒng)[13]。提示Neu可能在東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)機(jī)制發(fā)揮了重要作用，可能與補(bǔ)體殺傷日本血吸蟲(chóng)機(jī)制相關(guān)。

圖2 東方田鼠、BALB/c鼠感染日本血吸蟲(chóng)后血清生化指標(biāo)變化趨勢(shì)Fig.2 The dynamic changes of serum biochemical indexes from S. japonicum-infected Microtus fortis and BALB/c mouse

總蛋白和白蛋白含量及變化是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的敏感標(biāo)識(shí)[14]，也可反映機(jī)體的免疫功能狀況。血清白蛋白與球蛋白的比值可以反映機(jī)體免疫系統(tǒng)狀態(tài)，如果在適當(dāng)范圍內(nèi)球蛋白合成提高或白蛋白合成下降，機(jī)體免疫功能就會(huì)有增強(qiáng)趨勢(shì)。有研究表明，血吸蟲(chóng)可以利用宿主的白蛋白作為抗氧化劑，是蟲(chóng)體在宿主體內(nèi)生存必需的物質(zhì)[15-16]，Holtfreter等[17]研究表明，宿主的白蛋白是血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)在早期發(fā)育過(guò)程中的主要能量來(lái)源，也是成蟲(chóng)的輔助能量來(lái)源。邵偉娟等[18]研究發(fā)現(xiàn)東方田鼠正常生理狀態(tài)下血清白蛋白與球蛋白比例倒置。Li等[19]研究表明東方田鼠血清ALB與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)孵育可以誘導(dǎo)46.2%的童蟲(chóng)死亡率，顯著高于陰性對(duì)照；與對(duì)照組動(dòng)物相比，注射Mf-白蛋白的小鼠可誘導(dǎo)43.5%的減蟲(chóng)率和48.1%的減卵率。本研究結(jié)果顯示東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴后血清ALB含量顯著增加。要進(jìn)一步明確白蛋白在東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)特性中的作用還需要更深入的研究。血清高密度脂蛋白質(zhì)（high density lipoprotein，HDL）是肝病預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，與肝病病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，HDL降低是病情惡化的表現(xiàn)，當(dāng)患肝硬化或重型肝炎時(shí)，其含量會(huì)下降[20]。但是，HDL 可隨著病情的好轉(zhuǎn)而逐漸升高。HDL-C是臨床檢驗(yàn)的指標(biāo)，它代表了血液中HDL的水平。東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)后HDL-C不降反而逐漸升高，說(shuō)明其逐漸自愈血吸蟲(chóng)帶來(lái)的組織損傷。