潘潔明 陳惠琴 王昊 梅文莉 蔡彩虹 譚志瓊 戴好富

摘 ?要 ?為了研究原始熱帶雨林鸚歌嶺土壤放線菌（Streptomyces sp.）YG-7的次生代謝產(chǎn)物及其α-葡萄糖苷酶抑制活性，采用多種柱色譜方法對土壤放線菌YG-7的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到9個化合物，經(jīng)過波譜數(shù)據(jù)分析分別鑒定為：（1） 2-acetamido-5-chlorobenzamide， （2） cyclo （L-Pro-L-Leu）， （3） 3，6-dibenzylidene-2，5-piperazinedione， （4） albonoursin，

（5） （3Z，6S）-3-benzylidene-6-isobutylpiperazine-2，5-dione， （6） 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone， （7） isophthalic acid， （8） methyl 3-carbamoylbenzoate， （9） 2，3-dihydroxypropyl hexadecanoate. 其中，化合物1、7和8為新天然產(chǎn)物?；钚詼y試結(jié)果表明化合物1、3～5和7～8對α-葡萄糖苷酶具有明顯的抑制活性。

關(guān)鍵詞 ?放線菌;鸚歌嶺;化學(xué)成分;α-葡萄糖苷酶

中圖分類號 ?R915 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

Abstract ?The α-glucosidase activities of secondary metabolites from Streptomyces sp. YG-7 actinomycetes isolated from the soils collected from the virgin tropical rainforest Yingge Ridge were investigated. Nine compounds were isolated and purified by various chromatographic techniques， and the structures were identified as （1） 2-acetamido-5- chlorobenzamide， （2） cyclo （L-Pro-L-Leu）， （3） 3，6-dibenzylidene-2，5-piperazinedione， （4） albonoursin， （5） （3Z， 6S）-3-benzylidene-6-isobutylpiperazine-2，5-dione， （6） 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone， （7） isophthalic acid， （8） methyl 3-carbamoylbenzoate， and （9） 2，3-dihydroxypropyl hexadecanoate through a combined analysis of physicochemical properties and spectral data. Among them， compounds 1， 7 and 8 were new natural products， and compounds 1， 3–5， 7–8 exhibited significantly α-glucosidase inhibitory activity.

Keywords ?actinomycetes; Yingge Ridge; chemical constituent; α-glucosidase

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.026

放線菌是在自然界中分布極為廣泛的一類微生物，種類繁多，其次生代謝產(chǎn)物則具有結(jié)構(gòu)豐富、活性多樣的特點(diǎn)，是一類具有重要經(jīng)濟(jì)和生物研究價值的微生物資源[1-3]。目前臨床上使用的紅霉素、馬杜拉霉素、利富平和洋紅霉素等藥物，都直接或間接地來源于放線菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物[4]。土壤是放線菌的重要寄所，雖然對土壤放線菌的研究及應(yīng)用已有多年，但是目前發(fā)現(xiàn)的放線菌無論在數(shù)量還是種類上都只占到很少的部分，所以土壤仍是放線菌來源的巨大寶庫[5]。鸚歌嶺位于海南省樂東縣，屬于原始熱帶雨林（N 19°04.255′，E 109°57.037′），海拔1811 m，山高坡陡，人煙稀少，交通閉塞，絕大部分地區(qū)從未有過正規(guī)和大規(guī)模的開發(fā)利用[6]，表現(xiàn)出非常明顯的原始特征，對其中的土壤放線菌研究鮮有報道。本課題組對鸚歌嶺土壤中的放線菌進(jìn)行了分離，得到了168株放線菌菌株，研究發(fā)現(xiàn)其中3株放線菌的次生代謝產(chǎn)物具有體外酶抑制活性，9株具有抗菌活性，其中Streptomyces sp. YG-7發(fā)酵粗提物具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性。本研究對Streptomyces sp. YG-7進(jìn)行了次級代謝產(chǎn)物的分離，并從中共分離鑒定了9個化合物，其中化合物1，7和8為未報到過的天然產(chǎn)物?；钚詼y試結(jié)果表明化合物1，3～5和7～8對α-葡萄糖苷酶具有明顯的抑制效果。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌株 ?放線菌YG-7分離自海南省樂東縣鸚歌嶺（N 19°04.255′，E 109°57.037′，海拔619.6 m）的土壤中，保藏于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

1.1.2 ?儀器與試劑 ?Basis Hei-VAP Value旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph Laborota公司），Micromass Autospec-Uitima TOF質(zhì)譜儀（美國Waters公司），Brucker AV-500核磁共振波譜儀（以TMS為內(nèi)標(biāo)，瑞士 Bruker 公司）;安捷倫1260分析型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），戴安Summit P680A半制備高效液相色譜儀（美國戴安公司）;ELX-800酶標(biāo)儀（美國Bio-Tex公司），超凈工作臺，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;超純水裝置，廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司。α-葡萄糖苷酶，北京Solarbio公司;阿卡波糖，北京百靈威科技有限公司;Sephadex LH-20，德國Merck公司;C18反相材料，日本FU-JI公司;柱色譜硅膠和薄層色譜硅膠板，青島海洋化工廠產(chǎn)品;氘代試劑（CD3OD和CDCl3），德國Merck公司;色譜溶劑購自天津康科德公司;其他試劑均為重蒸工業(yè)試劑。

1.1.3 ?培養(yǎng)基 ?高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉

20.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4?7H2O 0.5 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4～7.6。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌株鑒定 ?將放線菌YG-7接種于高氏一號培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌株的形態(tài)特征。將放線菌YG-7接種于高氏一號培養(yǎng)基上，然后把滅菌的蓋玻片以45°插入培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)，菌絲體生長出來并附著在蓋玻片上時，輕輕地拔出蓋玻片，置于顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)。使用試劑盒[E.Z.N.A Bacterrial DNA Kit（50）]提取DNA，以27f（5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-TACGGCTACCTT GTTACGACTT-3′）作為引物（上海生工生物工程股份有限公司），對該菌株16S rDNA基因序列進(jìn)行測定，將測序結(jié)果提交于NCBI基因庫，并與BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對，并利用軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 ?菌株發(fā)酵 ?放線菌YG-7在高氏一號培養(yǎng)基中活化后，挑取單個菌落接種到裝有100 mL高氏一號液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于28?℃， 200 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)2 d，得到種子液，按4%接種量接種到1 L三角瓶中（含400 mL培養(yǎng)基），28?℃，200 r/min條件下發(fā)酵8 d，共發(fā)酵120瓶。

1.2.3 ?提取與分離 ?菌株發(fā)酵結(jié)束后，在發(fā)酵液

中加入1∶1乙酸乙酯，用Bruker FA25勻漿機(jī)破

碎菌絲與孢子，重復(fù)萃取3遍，回收合并乙酸乙酯相，減壓濃縮，獲得乙酸乙酯提取物（66.0 g）。

將提取物用95%甲醇溶解，以1∶1用石油醚萃取，

除去石油醚層，減壓濃縮得到23.0 g膏狀粗提物。

將粗提物經(jīng)過減壓硅膠柱色譜，得到20個流份（Fr.1～Fr.20）。Fr.7（1.1 g）以甲醇-水為流動相，經(jīng)C18反相硅膠柱色譜梯度洗脫，得到15個流分（Fr.7-1～Fr.7-15）。Fr.7-3和Fr.7-6分別經(jīng)重結(jié)晶方法得到白色晶體即化合物6（2.1 mg）和米黃色晶體即化合物7（5.9 mg）。Fr.7-7和Fr.7-8分別經(jīng)半制備高效液相色譜（C18柱，甲醇-水為流動相，流速4 mL/min;檢測波長200、254 nm/ 200、220 nm）分離得到化合物1（2.5 mg，保留時間13.5 min）、2（1.1 mg，保留時間11 min）和8（1.0 mg，保留時間15.5 min）。Fr.7-11依次經(jīng)過Sephadex LH-20、硅膠柱色譜和半制備高效液相色譜分離純化得到化合物3（1.6 mg）、9（8.5 mg）和4（2.0 mg）。Fr.7-12經(jīng)半制備高效液相色譜 （C18柱，40%甲醇-水，流速4 mL/min;檢測波長200、220 nm）分離得到化合物5（1.2 mg，保留時間18.5 min）。

1.2.4 ?α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選 ?使用PNPG（4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷）法[7]對化合物1～9的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行評價。0.2 mol/L的PBS溶液（pH 6.8）作為反應(yīng)溶液，樣品終質(zhì)量濃度為500 μg/mL，陰性對照為DMSO PBS溶液，陽性對照為阿卡波糖溶液（500 μg/mL），將混勻的各溶液加入到96孔酶標(biāo)板后，于37 ℃放置15 min后，加入PNPG溶液20 μL，然后將96孔板于37?℃放置15 min后，加入0.2 mol/L的Na2CO3終止液80 μL，于酶標(biāo)儀405 nm波長下測定吸光度值，并計算化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制率。結(jié)果見表1。

抑制率=[（B-B0）-（A-A0）]/（B-B0）其中，A0：背景對照組吸光值;A：實(shí)驗組吸光值;B0：空白對照組吸光值;B：陰性對照組吸光值。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?菌株鑒定

放線菌YG-7在高氏一號培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈圓形，邊緣不規(guī)則，中間略微凸起，灰色，有放射狀菌絲產(chǎn)生（圖1A）。分生孢子梗細(xì)長，分生孢子為球形，呈串狀生長，末端蜷曲呈圈（圖1B）。通過PCR擴(kuò)增獲得菌株YG-7的16S rDNA基因序列，GenBank登錄號為KY860902。將該

序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比對，選取與其同源性較高的菌株，使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果顯示，菌株YG-7與Streptomyces yunnanensis（AF346818）在同一分支上，且與Streptomyces yunnanensis相似度達(dá)99%以上，因此，鑒定該菌株為Streptomyces sp. YG-7。

A：菌落

A： Colony of YG-7

B：分生孢子梗及分生孢子（光學(xué)顯微鏡40×）

B： Conidiophores and conidia （Light microscope 40×）

2.2 ?結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，分子式為C9H9ClN2O2; ESI-MS m/z ： 235[M+Na]+; 1H-NMR （CD3OD， 500 MHz） δH ： 8.37 （1H， d， J=8.9 Hz， H-3）， 7.75 （1H， d， J=2.5 Hz， H-6）， 7.46 （1H， dd， J=8.9 Hz， 2.5 Hz， H-4）， （C-5， C-6）， 171.4 （C-7）， 172.0 （C-8）， 24.7 （C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報道基本一致，確定化合物1為2-acetamido-5-chlorobenzamide。

化合物2：粉色粉末，分子式為C11H18N2O2; ESI-MS m/z ： 211[M+H]+; 1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH ： 4.17 （1H， m， H-6）， 4.03 （1H， d， J=6.3 Hz， H-9）， 3.61～3.66 （1H， m， H-3α）， 3.56～3.60 （1H， m， H-3β）， 2.36 （2H， m， H-10）， 2.13～2.23 （1H， m， H-5α， 11）， 2.04～2.06 （1H， m， H-4α）， 1.89～1.93 （1H， m， H-5β）， 1.72～1.78 （1H， m， H-4β）， 0.96 （3H， d， J=6.6 Hz， H-12）， 1.01 （3H， d， J=6.6 Hz， H-13）; 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC ： 166.4 （C-1）， 45.7 （C-3）， 23.5 （C-4）， 28.3 （C-5）， 59.1 （C-6）， 163.7 （C-7）， 53.5 （C-9）， 38.8 （C-10）， 24.9 （C-11）， 21.3 （C-12）， 22.9 （C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道基本一致，確定化合物2為cyclo（L-Pro-L-Leu）。

化合物3：黃色粉末，分子式為C18H14N2O2; ESI-MS m/z ： 329[M+K]+; 1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH ： 8.19 （2H， s， 1， 4-NH）， 7.47 （4H， t， J=7.5 Hz， H-9， 13， 16， 20）， 7.40 （6H， m， H-10， 11， 12， 17， 18， 19）， 7.04 （2H， s， H-7， 14）; 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC ： 116.9 （C-2， 5）， 157.1 （C-3， 6）， 129.7 （C-7， 14）， 132.8 （C-8， 15）， 129.2 （C-9， 13， 16， 20）， 128.6 （C-10， 12， 17， 19）， 125.7 （C-11， 18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道基本一致，確定化合物3為3，6-dibenz ylidene-2，5-piperazinedione。

化合物4：白色粉末，分子式為C15H16N2O2; ESI-MS m/z ： 257[M+H]+; 1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH ： 8.19 （1H， s， 4-NH）， 8.12 （1H， s， 1-NH）， 7.34～7.45 （5H， m， Ar-H）， 6.99 （1H， s， H-7）， 6.02 （1H， d， J=10.2 Hz， H-14）， 2.61 （1H， m， H-15）， 1.12 （6H， d， J=6.6 Hz， H3-16， 17）; 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC ： 124.4 （C-2）， 157.5 （C-3）， 125.9 （C-5）， 157.3 （C-6）， 116.4 （C-7）， 132.9 （C-8）， 128.5 （C-9， 13）， 129.7 （C-10， 12）， 129.0 （C-11）， 127.4 （C-14）， 25.7 （C-15）， 22.2 （C-16， 17）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道基本一致，確定化合物4為albonoursin。

化合物5：白色粉末，分子式為C15H18N2O2; ESI-MS m/z ： 259[M+H]+; 1H-NMR （CDCl3， 500 MHz）δH：7.86 （1H， s， 1-NH）， 7.44 （2H， m， H-9， 13）， 7.35 （3H， m， H-10， 11， 12）， 7.00 （1H， s， H-7）， 6.07 （1H， s， 4-NH）， 4.19 （1H， m， H-5）， 1.86 （2H， m， H-14）， 1.78 （1H， m， H-15）， 1.02 （3H， d， J=6.2 Hz， H-16）， 0.98 （3H， d， J=6.2 Hz， H-17）; 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC ： 125.4 （C-2）， 159.6 （C-3）， 54.4 （C-5）， 166.3 （C-6）， 116.3 （C-7）， 132.9 （C-8）， 128.9 （C-9， 13）， 129.6 （C-10， 12）， 128.6 （C-11）， 43.8 （C-14）， 24.5 （C-15）， 23.1 （C-16）， 21.4 （C-17）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道基本一致，確定化合物5為（3Z， 6S）-3-benzylidene-6-isobutylpiperazine-2， 5- dione。

化合物6：米白色晶體，分子式為C6H6O3; ESI-MS m/z ： 127[M+H]+; 1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH ： 7.71 （1H， d， J=5.5 Hz， H-6）， 6.42 （1H， d， J=5.5 Hz， H-5）， 2.37 （3H， s， H-7）; 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC ： 148.8 （C-2）， 143.2 （C-3）， 173.0 （C-4）， 113.0 （C-5）， 154.4 （C-6）， 14.4 （C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，確定化合物6為3-hydroxy-2-methyl-4- pyrone。

化合物7：淺黃色粉末，分子式為C8H6O4; ESI-MS m/z ： 167[M+H]+; 1H-NMR （CD3OD， 500 MHz） δH ： 8.65 （1H， t， J=1.7 Hz， H-2）， 8.24 （2H， dd， J=7.8 Hz， 1.7 Hz， H-4， 6）， 7.60 （1H， t， J=7.8 Hz， H-5）; 13C-NMR （CD3OD， 125 MHz） δC ： 132.5 （C-1， 3）， 131.9 （C-2）， 134.9 （C-4， 6）， 129.8 （C-5）， 168.9 （C-7， 8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道基本一致，確定化合物7為isophthalic acid。

化合物8：棕色粉末，分子式為C9H9NO3; ESI-MS m/z ： 180[M+H]+; 1H-NMR （CD3OD， 500 MHz）δH：8.54 （1H， dd， J=1.7， 1.7 Hz， H-2）， 8.19 （1H， ddd， J=7.8， 1.3， 1.3 Hz， H-4）， 8.11 （1H， ddd， J=7.8， 2.8， 2.8 Hz， H-6）， 7.60 （1H， t， J=7.8 Hz， H-5）， 3.94 （3H， s， H-8）; 13C-NMR （CD3OD， 125 MHz） δC ： 135.6 （C-1）， 129.7 （C-2）， 131.8 （C-3）， 133.6 （C-4）， 129.9 （C-5）， 133.1 （C-6）， 167.8 （C-7）， 52.8 （C-8）， 171.1 （C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道基本一致，確定化合物8為methyl 3-carbamoylbenzoate。

化合物9：棕色油狀，分子式為C19H38O4; ESI-MS m/z ： 331[M+H]+; 1H-NMR （CD3OD， 500 MHz） δH： 4.08 （2H， m， H-3）， 3.80 （1H， m， H-2）， 3.53 （2H， m， H-1）， 2.34 （2H， t， J=7.8 Hz， H-5）， 1.60 （2H， m， H-6）， 1.23-1.35 （24H， m， H-7-18）， 0.86 （3H， m， H-19）; 13C-NMR （CD3OD， 125 MHz） δC： 64.1 （C-1）， 71.1 （C-2）， 66.5 （C-3）， 175.5 （C-4）， 34.9 （C-5）， 23.8 （C-6）， 26.0～33.1 （C-7-18）， 14.5 （C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道基本一致，確定化合物9為2，3-dihydroxypropyl hexadecanoate。

2.3 ?活性測試

采用PNPG法測定化合物1～9的α-葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果表明，化合物1、3～5和7～8具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，具體活性結(jié)果見表1。

3 ?討論

本研究通過多種色譜技術(shù)從原始熱帶雨林鸚歌嶺土壤放線菌YG-7中分離得到9個化合物，其中化合物1、7和8為新天然產(chǎn)物，化合物2～5為二酮哌嗪類化合物。二酮哌嗪類化合物在自然界中廣泛存在，生物活性多樣，包括抑菌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗動脈硬化等[17]，其中關(guān)于抑菌和抗腫瘤的報道較多，而對α-葡萄糖苷酶抑制活性卻少有報道。本研究發(fā)現(xiàn)的4個二酮哌嗪類化合物中有3個（3～5）表現(xiàn)出了α-葡萄糖苷酶抑制活性，只有化合物2在相同濃度下未見其抑制效果，其原因可能是化合物3～5結(jié)構(gòu)中的苯烯基對活性起到了關(guān)鍵作用，但還需更多的研究進(jìn)一步驗證。化合物4的α-葡萄糖苷酶活性略強(qiáng)于化合物3，推測結(jié)構(gòu)中14位的取代基為苯環(huán)時相比異丙基有微弱的增強(qiáng)作用?；衔?和5相比，化合物5的活性更顯著，由此推測，化合物5中C6-C7為單鍵時更利于α-葡萄糖苷酶抑制活性。

放線菌是一類能產(chǎn)生豐富活性次級代謝產(chǎn)物的微生物資源，在藥物研究與開發(fā)中占有極其重要的地位。雖然該來源的藥物在20世紀(jì)70年代達(dá)到高峰，之后從中發(fā)現(xiàn)新藥物的速率變得緩慢，但Watve等[18]研究認(rèn)為，放線菌的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生潛力還遠(yuǎn)未挖掘出來，目前所發(fā)現(xiàn)的僅占3%左右，而且鸚歌嶺尚屬于未開發(fā)地帶，特殊的植被賦予土壤滋養(yǎng)不同的放線菌菌群。本次對其中Streptomyces sp. YG-7次生代謝產(chǎn)物得研究就發(fā)現(xiàn)了二酮哌嗪類、吡喃酮類、酚酸類和脂肪酸類等不同化合物結(jié)構(gòu)類型的化合物，說明其代謝產(chǎn)物豐富多樣，所以從鸚歌嶺土壤來源的放線菌的次生代謝物中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的先導(dǎo)化合物前景依然廣闊。

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