王藝，李妍，謝天平，王喆，張梅

(石河子大學(xué)藥學(xué)院藥理系,新疆 石河子 832000)

癌癥，是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康、導(dǎo)致現(xiàn)代人類(lèi)死亡的第一大惡疾和頑癥。世界衛(wèi)生組織調(diào)查結(jié)果顯示，在世界范圍內(nèi)惡性腫瘤的死亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。據(jù)聯(lián)合國(guó)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2014年全球平均每8個(gè)死亡病例中就有1人死于癌癥，這比艾滋病、結(jié)核病和瘧疾導(dǎo)致的死亡人數(shù)總和還要高，每年全球還有1000多萬(wàn)人被確診患上癌癥。近20年，我國(guó)的惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升，目前國(guó)內(nèi)多數(shù)醫(yī)院收治的腫瘤患者中，以中晚期居多，并且治愈率較低,死亡率高，給我國(guó)的社會(huì)和醫(yī)療帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。雖然對(duì)細(xì)胞癌變的機(jī)制的認(rèn)識(shí)在不斷深入，然而人們?cè)诳刂瓢┌Y的征途中步履維艱，進(jìn)展緩慢，人類(lèi)將面臨著防治惡性腫瘤的新挑戰(zhàn)。因此,實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷對(duì)于有效治療和改善預(yù)后轉(zhuǎn)歸尤為重要[1]。尋找新的抗癌藥物和探討其分子機(jī)制是目前癌癥防治措施研究的重點(diǎn)。

很多研究都證實(shí)，桑樹(shù)中抗癌主要成分是黃酮類(lèi)化合物，這些黃酮類(lèi)化合物中，桑根酮C(Sanggenon C)含量較高。目前桑根酮C藥理學(xué)研究被證實(shí)具有明顯的降壓、抗炎作用，但其抗癌作用方面研究鮮有報(bào)道。國(guó)外僅研究了桑根酮C對(duì)PKC、ODC和COX-1等癌癥相關(guān)因子有抑制作用[2-4]，而國(guó)內(nèi)目前主要研究其提取工藝[5]。在國(guó)內(nèi)外研究的基礎(chǔ)之上，本文研究了桑根酮 C體內(nèi)體外抗腫瘤作用，旨在探究桑樹(shù)中抗癌活性成分，為臨床癌癥治療提供手段和理論依據(jù)，為新疆藥用植物桑的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

桑根酮C(SC,寶雞市辰光生物科技有限公司)，5-氟尿嘧啶(美侖生物)，1640(HyClone)，PBS，0.4%SRB溶液，胰蛋白酶(BOSTRE)，B16F0細(xì)胞、B16F10細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、小鼠肝癌細(xì)胞H22由石河子大學(xué)藥學(xué)院藥理系提供,昆明種小鼠由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

B16F0細(xì)胞、B16F10細(xì)胞、HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%的雙抗RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖測(cè)定

1×104個(gè)腫瘤細(xì)胞(B16F0細(xì)胞、B16F10細(xì)胞、HepG2細(xì)胞)接種于96孔板內(nèi)，24 h后，用不同濃度的桑根酮C (5、10、20、40、80 μmol/L)處理腫瘤細(xì)胞48 h。采用SRB法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。

1.4 黑色素含量的測(cè)定

接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F0、B16F10細(xì)胞以每孔1.0×105鋪于6孔板，加入B16F0的SC終濃度為20、40、80 μmol/L；加入B16F10的SC終濃度為60、80、100 μmol/L。桑根酮C處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞于離心管內(nèi)，用PBS洗一次一并倒入離心管，3500 r/min離心5 min，收集上清液,取1 mL上清液加入1 mL 0.4 mol/L HEPES buffer (pH 6.8)和1 mL溶液(乙醚∶乙醇=1∶1)。取下層水相于96孔板內(nèi)，每組5個(gè)平行孔。細(xì)胞沉淀計(jì)數(shù)后加入含10%DMSO-NaOH 1.5 mL于80 ℃煮1 h, 3 500 r/min離心10 min,取上清液鋪96孔板，每組5個(gè)平行孔。在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)，計(jì)算黑色素含量。

1.5 對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞移植動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)和臟器指數(shù)的影響

取昆明小白鼠，制備H22小鼠肝癌細(xì)胞懸液，每只小鼠腋窩皮下接種2×106/mL的細(xì)胞懸液(0.2 mL/只)，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成5組，分別為模型組、5-FU(20 mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組、桑根酮C的低 (12.5 mg/kg)、中(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)3個(gè)劑量組。

在接種后第1天開(kāi)始，均采取腹腔注射給藥，連續(xù)處理10 d。末次給藥24 h后，處死動(dòng)物，剝離瘤組織并稱重，剝?nèi)⌒?、肝、腎、脾等臟器并稱重，計(jì)算抑瘤率和臟器指數(shù)變化。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

5～80 μmol/L的桑根酮C有明顯抑制B16F0、B16F10、HepG2細(xì)胞增殖作用(圖1)，尤其抑制HepG2作用最為明顯，細(xì)胞的IC50值分別為59.08±0.04、130.17±0.03、50.58±0.03 μmol/L。由結(jié)果可知，HepG2細(xì)胞對(duì)桑根酮C最敏感。

注：與空白組比較, * P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001圖1 桑根酮C抑制細(xì)胞增殖Fig.1 The proliferative inhibition of sanggenon C on cancer cells n=3)

2.2 細(xì)胞內(nèi)、外黑色素含量的測(cè)定

當(dāng)B16F0與SC作用時(shí)，與未加藥的B16F0細(xì)胞對(duì)比，20、40、80 μmol/L的SC能使B16F0細(xì)胞黑色素生成增加，且呈劑量依賴性(圖2)。細(xì)胞外黑色素含量與對(duì)照組相比，分別為對(duì)照組的2.43±0.06倍，3.72±0.03倍，6.74±0.07倍；細(xì)胞內(nèi)黑色素含量與對(duì)照組相比，分別為對(duì)照組的3.10±0.40倍，3.95±0.46倍，7.92±0.89倍。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，20、40、80 μmol/L藥物處理組較未加藥組有極顯著性差異(P<0.01)。

相同濃度的SC作用于B16F10細(xì)胞后，與未加藥的B16F10細(xì)胞對(duì)比，SC能使B16F10細(xì)胞黑色素生成增加，且呈劑量依賴性(圖2)。細(xì)胞外黑色素含量與對(duì)照組相比，分別為對(duì)照組的1.22±0.03、1.90±0.01、4.26±0.09倍；細(xì)胞內(nèi)黑色素含量與對(duì)照組相比，分別約為對(duì)照組的1.18±0.04、1.50±0.03、1.97±0.03倍。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，80、100 μmol/L組較未加藥組有極顯著性差異(P<0.01)，60 μmol/L組較未加藥組有顯著性差異(P<0.05)。

注：與空白組比較, *P<0.05, ** P<0.01圖2 桑根酮C抑制細(xì)胞增殖Fig.2 Effect of SC on melanin levels in cancer cells n=3)

2.3 桑根酮C抑制小鼠H22移植瘤的生長(zhǎng)

建立小鼠H22腫瘤模型,腹腔注射給藥，給藥期間小鼠對(duì)藥物耐受性良好，體重變化不大。

桑根酮C各組小鼠體重與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，表明桑根酮C對(duì)小鼠的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響(表1)。

桑根酮C高中低3個(gè)劑量組均對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，抑制率為35.01%～47.65%，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)，且在該劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系(圖3)。

表1 桑根酮C對(duì)荷瘤小鼠體重和瘤重的影響Tab.1 The effect of Sangenone C on the tumor growth and body weight of H22 mice

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01,*P<0.05。

注：**P<0.01,*P<0.05圖3 桑根酮C對(duì)小鼠H22移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用與模型組比較Fig.3 inhibitory effect of sanggenon C on H22 tumor of mice

2.4 桑根酮C對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

肝的臟器系數(shù)顯示(圖4)，桑根酮C高中低劑量組均小于陽(yáng)性對(duì)照組，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其腎臟指數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組、空白組比較沒(méi)有顯著性差異；桑根酮C對(duì)心臟的作用(圖4)，高中低劑量組與空白組、陽(yáng)性對(duì)照組比較沒(méi)有顯著性差異。

脾臟系數(shù)變化結(jié)果顯示(圖4)，高、中、低3個(gè)劑量的脾臟系數(shù)比空白組大，而比模型組小。低劑量組與空白組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。毒理學(xué)中,臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等，臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變[6-7]。通過(guò)以上分析可見(jiàn)，桑根酮C對(duì)小鼠脾臟、心臟、腎臟毒性比5-FU組小。

圖4 桑根酮C對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響Fig.4 Effect of Sanggenon C on viscera index in mice with tumor

3 討論

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康和生命，已成為人類(lèi)死亡的第一殺手。近幾十年，國(guó)內(nèi)外惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。癌癥的治療手段主要是手術(shù)切除、放療、化療。雖然治療手段多，但化療藥物是必不可少的。對(duì)于較早期未擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移的癌灶，采用手術(shù)切除或放療較為成功，但對(duì)于晚期的腫瘤患者治療效果不大；而且放療、化療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)殺死增殖旺盛的正常細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致嘔吐、腹瀉、脫發(fā)和骨髓抑制等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響了患者的生活。目前臨床采用的化療藥物帶來(lái)的不良反應(yīng)重、多，而且容易耐藥，導(dǎo)致預(yù)后效果差。由于常用的抗腫瘤藥物毒性大，選擇性差，在應(yīng)用中受到很大的限制，從而影響了藥物的療效。因此迫切需要尋找一種新的低毒的藥物和方法治療腫瘤。

桑根酮C是一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物，存在于從?？浦参锷０灼ぶ衃6-8]。桑白皮為桑科植物桑的干燥根皮，具有抗癌、抗炎、降血壓、降血糖、和抗動(dòng)脈粥樣硬化藥理作用，臨床可用于治療前列腺癌、高血壓，高血脂和高血糖等疾病[9-13]。桑白皮的甲醇提取物可通過(guò)抑制NF-ΚB的衰減從而誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞的凋亡，而且可以靶向殺滅腫瘤干細(xì)胞[14]，桑根酮C是桑根酮中含量高活性強(qiáng)的成分，可以作為候選抗癌藥物使用。

本研究通過(guò)觀察桑根酮C對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)該化合物能顯著抑制黑色素瘤和肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。同時(shí)通過(guò)考察桑根酮C 對(duì)移植瘤小鼠動(dòng)物模型的影響，結(jié)果表明該化合物不僅能顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，而且對(duì)小鼠的體重、生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響。桑根酮C作用于B16F10、B16F0細(xì)胞時(shí)，結(jié)果顯示使細(xì)胞外黑色素生成增加，而且較未加藥組有極顯著性差異，說(shuō)明桑根酮C具有抑制黑色素瘤的作用。桑根酮C對(duì)小鼠的臟器指數(shù)的影響結(jié)果顯示，與模型組比較，對(duì)臟器指數(shù)的影響很小；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，臟器毒性也很小。由以上結(jié)果可知，桑根酮C具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤作用。本研究未涉及桑根酮C抗腫瘤作用的機(jī)制，需要通過(guò)進(jìn)一步研究探討，闡明該化合物的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)，為該化合物的藥用開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。本研究還需進(jìn)一步深入考察該化合物毒性反應(yīng)及體內(nèi)過(guò)程，為尋找新的高效低毒抗癌藥物奠定基礎(chǔ)。