梁 姍，劉 歡

長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 408100

花青素(anthocyanin)是黃酮屬的天然色素，廣泛的存在于具有不同顏色的植物中，如藍(lán)莓、黑莓和紫甘薯等，在自然狀態(tài)下往往與各種糖苷形成花青苷[1，2]。研究表明，花青素具有清除自由基、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗癌、皮膚保健和抗衰老等功能[3-5]。從植物中提取天然花青素的技術(shù)較成熟，但花青素容易受到金屬離子、二次色素、溫度、光照、pH值等因素的影響，導(dǎo)致色素降解及活性降低[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)酰化可以改善對(duì)花青素的顏色保護(hù)，提高青素的穩(wěn)定性。朱玉良等[9]發(fā)現(xiàn)對(duì)黑枸杞花青素進(jìn)行蘋果酸?；男允蛊浒胨テ诤捅Ａ袈示@著上升。趙立儀等[10]發(fā)現(xiàn)?；{(lán)莓花青素及矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)溫度、光照、強(qiáng)氧化劑、食品添加劑的穩(wěn)定性有顯著提高。胭脂蘿卜(carmine radish)是重慶市涪陵區(qū)特有的蔬菜品種，主要用于制備食用紅色素，研究發(fā)現(xiàn)其紅色素為花青素類天竺葵素，具有良好的抗氧化、抑菌性，但其穩(wěn)定性較差，如何進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性成為該色素開發(fā)和利用的關(guān)鍵[11-13]。本研究采用水楊酸?；蛛x自胭脂蘿卜的天竺葵素，探討其對(duì)光照、溫度、pH、抗氧化性等的穩(wěn)定性，為該色素的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

天竺葵素采用液相色譜儀分離自胭脂蘿卜(純度> 95%)，由長江師范學(xué)院天然產(chǎn)物研究實(shí)驗(yàn)室分離獲得；無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸鎂、雙氧水、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸鋁、鹽酸、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純，為重慶川東化工(集團(tuán))有限公司產(chǎn)品；水楊酸為上海遠(yuǎn)帆助劑廠產(chǎn)品；維生素C為上海伊卡生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

ΜLtiMate 3000 XR液相色譜儀，美國 Thermo 公司產(chǎn)品 ；Optima MAX-XP，冷凍超速離心機(jī) 德國 Beckman 公司產(chǎn)品； UV 3010紫外-可見分光光度計(jì)，日本日立科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；UPT 超純水制造機(jī)，中國優(yōu)普公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 天竺葵素的?；幚?/p>

稱取1.0 g水楊酸加入2 mL沸水溶解，溶解后的水楊酸溶液與天竺葵素溶液按照濃度比1∶1 (w/w)混合，在28 ℃下反應(yīng)2 h，將反應(yīng)液稀釋后用紫外分光光度計(jì)在200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行快速掃描，結(jié)果根據(jù)在300～350 nm處吸收峰變化來確定?；痆14]。

1.2.2 ?；祗每乇Ａ袈实臏y(cè)定方法

采用天竺葵素標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%， CAS：134-04-3)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定胭脂蘿卜天竺葵素的含量，并通過含量比計(jì)算保留率[15]。

保留率(%)=(保存后天竺葵素含量/初始天竺葵素含量)×100

1.2.3 各因素對(duì)?；僦}卜天竺葵素穩(wěn)定性的影響

1.2.3.1 天竺葵素的光穩(wěn)定性

各取未?；王；?0 mL天竺葵素裝至白色透光的試劑瓶中，放在自然光照條件的壞境中，隔天定時(shí)測(cè)定其保留率的變化，共測(cè)5天。

1.2.3.2 天竺葵素的熱穩(wěn)定性

取酰化與未?；奶祗每厝芤焊?0 mL置于80、100、120 ℃，于2、4、6、8、10 h后分別測(cè)定其含量變化。

1.2.3.3 金屬離子對(duì)天竺葵素的影響

各取?；c未?；奶祗每孛糠?0 mL，分別加入濃度為0.01 mol/L的硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸鋁、硫酸鋅溶液，于2、4、6、8、10 h后分別測(cè)定其含量變化。

1.2.3.4 pH對(duì)天竺葵素的影響

將?；c未酰化的天竺葵素分別用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)酸堿度，分別測(cè)定pH為2、4、6、8、10、12含量的變化。

1.2.3.5 H2O2對(duì)天竺葵素的影響

各取未?；王；?0 mL天竺葵素，分別加入濃度為1%、2%、3% VC溶液和1%、5%、10%過氧化氫溶液，于2、4、6、8、10 h后分別測(cè)定其含量變化。

1.2.4 胭脂蘿卜天竺葵素抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.2.4.1 羥基自由基(·OH)的清除

取2 mL 6 mmol/ L硫酸亞鐵溶液、2 mL 6 mmol/ L水楊酸溶液及、2 mL不同濃度的天竺葵素溶液，最后加入2 mL H2O2，混合均勻后37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，4 000 rpm冷凍離心5 min，取上清液在510 nm下測(cè)吸光度作為試驗(yàn)組，記為Ai；用蒸餾水代替樣品作為空白組，記為A0；以蒸餾水代替H2O2作為對(duì)照組，記為Ai0；用VC作為陽性對(duì)照，按下式計(jì)算對(duì)自由基的清除率[16]：

1.2.4.2 DPPH自由基的清除

取2 mL不同濃度的天竺葵素溶液，加入2 mL的 DPPH溶液作為試驗(yàn)組，在黑暗環(huán)境下反應(yīng)30 min后，在波長517 nm下測(cè)定其吸光度(Ai)；以2 mL待測(cè)溶液加入2 mL的無水乙醇作對(duì)照(Ai0)，以2 mL的DPPH溶液加入2 mL蒸餾水中作空白(A0)，用VC作陽性對(duì)照，計(jì)算對(duì)DPPH自由基的清除率[17]：

1.2.4.3 ABTS自由基的清除

取10 mL，7 mmol/L ABTS和176 μL，140 mmol/L過硫酸鉀混合均勻置于黑暗處室溫反應(yīng)24 h，得到儲(chǔ)備液。再用乙醇稀釋成工作液，在734 nm波長下吸光度在0.68～0.72范圍內(nèi)。分別移取0.1 mL不同濃度的天竺葵素溶液于25 mL比色管中，再添加5 mL ABTS工作液，混合均勻后在室溫下反應(yīng)30 min，于734 nm下測(cè)其吸光度，作為試驗(yàn)組記為Ai；用蒸餾水代替天竺葵素溶液作為空白組記為A0；用乙醇代替ABTS工作液作為對(duì)照組記為Ai0。按下列公式計(jì)算ABTS自由基的清除率[18]：

2 結(jié)果

2.1 ?；僦}卜天竺葵素的紫外吸收光譜

測(cè)定胭脂蘿卜天竺葵素在200～600 nm的吸收光譜，觀察在300～350 nm 的波峰情況，如有波峰變化則說明發(fā)生了?；痆15]。如圖1所見，胭脂蘿卜天竺葵素與水楊酸發(fā)生?；磻?yīng)后，在紫外光譜中317 nm處出現(xiàn)吸收峰，說明胭脂蘿卜天竺葵素已經(jīng)酰化。

圖1 胭脂蘿卜天竺葵素的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of pelargonidin注：A:未酰化；B:?；弧??；辗?。Note:A:unacylation;B:acylation;↓:acylation absorption peak.

2.2 ?；祗每貙?duì)光照穩(wěn)定性的影響啊

由圖2可見，10天內(nèi)隨光照時(shí)間的延長，未?；c?；祗每乇Ａ袈示饾u下降，?；祗每氐姆€(wěn)定性均顯著高于未?；奶祗每?P<0.05)，光照第10天時(shí)，?；祗每氐谋Ａ袈试?1.28%左右，而未酰化天竺葵素的保留率已降到61.33%左右。酰化后的天竺葵素的光穩(wěn)定性顯著高于未?；祗每?P<0.05)。

圖2 光照對(duì)天竺葵素保留率的影響Fig.2 The effect of illumination on the retention rate of pelargonidin

2.3 ?；祗每貙?duì)溫度穩(wěn)定性的影響

由圖3可見，隨著溫度的升高和時(shí)間的延長，酰化前后天竺葵素的保留率均下降。在80 ℃下2 h后，酰化天竺葵素保留率均顯著大于未?；祗每?P<0.05)。在100 ℃下2 ～6 h，?；祗每乇Ａ袈逝c未?；祗每貨]有顯著性差異，在8 ～10 h時(shí)差異極顯著(P<0.01)。120 ℃下2 ～4 h，?；c未?；祗每乇Ａ袈蕸]有顯著性差異，在6 ～10 h時(shí)差異顯著(P<0.05)。在80、100、120 ℃加熱10 h后酰化天竺葵素保留率分別為81.59%、71.82%、58.03%，未酰化天竺葵素為71.59%、60.04%、49.27%，?；祗每鼐@著高于未被?；祗每?，說明?；祗每氐臒岱€(wěn)定性顯著提高。

圖3 溫度對(duì)天竺葵素保留率的影響Fig.3 The effects of temperature on the retention rate of pelargonidin注：A:80 ℃；B:100 ℃；C:120 ℃。Note:A:80 ℃；B:100 ℃；C:120 ℃.

2.4 ?；祗每貙?duì)金屬離子穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增長，0.01 mol/L的四種金屬離子對(duì)未?；王；祗每氐姆€(wěn)定性均有顯著影響(P<0.05)。其中Fe2+、 Mg2+、Zn2+對(duì)未?；c酰化天竺葵素的保留率影響差異不顯著，而Al3+對(duì)已?；臀歹；祗每氐姆€(wěn)定性影響有顯著性差異(P<0.05)，說明?；蟮奶祗每貙?duì)金屬離子的穩(wěn)定性和金屬離子的類型有關(guān)，對(duì)Fe2+、Mg2+和Zn2+穩(wěn)定性好于Al3+。

圖4 金屬離子對(duì)天竺葵素保留率的影響Fig.4 The effect of metal ion the retention rate of pelargonidin注：A:Fe2+；B:Al3+；C:Mg2+；D:Zn2+。Note:A:Fe2+；B:Al3+；C:Mg2+；D:Zn2+.

2.5 ?；祗每貙?duì)pH穩(wěn)定性的影響

天竺葵素受pH影響較大，當(dāng)pH值小于3時(shí)，天竺葵素呈穩(wěn)定的紅色；當(dāng)pH值在3～6范圍之間時(shí)，紅色變淺；當(dāng)pH值大于6時(shí)，呈不穩(wěn)定的藍(lán)色[19]。由圖5可知，胭脂蘿卜天竺葵素在pH<6時(shí)，即酸性條件下較為穩(wěn)定，在堿性條件下保留率下降顯著(P<0.05)。?；祗每氐谋Ａ袈曙@著高于未?；奶祗每?P<0.05)。

圖5 pH對(duì)?；祗每乇Ａ袈实挠绊慒ig.5 The effect of pH on the retention rate of pelargonidin

2.6 ?；祗每貙?duì)H2O2穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，在反應(yīng)2～8 h內(nèi)，添加10%過氧化氫對(duì)天竺葵素的保留率無顯著影響(P>0.05)，在8 h后，酰化天竺葵素的保留率顯著高于未?；祗每?P<0.05)，說明在長時(shí)間反應(yīng)后?；祗每貙?duì)強(qiáng)氧化劑的穩(wěn)定性提高，而且短時(shí)間內(nèi)?；祗每氐膬?yōu)勢(shì)并不顯著。

圖6 H2O2對(duì)天竺葵素保留率的影響Fig.6 The effect of H2O2 on the retention rate of pelargonidin

2.7 ?；祗每乜寡趸钚栽u(píng)價(jià)

2.7.1 對(duì)羥自由基(·OH)的清除效果

由圖7可知，當(dāng)?；祗每亍⑽歹；祗每嘏cVC濃度在0.5 ～2.5 mg/mL內(nèi)時(shí)，對(duì)羥基的清除率均隨濃度的增加而增大。相同濃度的VC對(duì)羥自由基的清除率均低于天竺葵素(P<0.05)，?；?/p>

圖7 天竺葵素對(duì)羥自由基的清除率Fig.7 Pelargonidin removal rate of hydroxyl radicals

后天竺葵素對(duì)羥自由基的清除能力未見顯著差異，說明胭脂蘿卜天竺葵素具有良好的羥自由基清除能力，且水楊酸?；从绊懫淝宄u自由基的能力。

2.7.2 對(duì)DPPH自由基的清除效

如圖8所示，當(dāng)在0.2～0.8 mg/mL間，酰化天竺葵素、未酰化天竺葵素和VC對(duì)DPPH自由基的清除率均隨著濃度的增加而增加。當(dāng)濃度達(dá)到0.8 mg/mL時(shí)，天竺葵素對(duì)DPPH清除率達(dá)到最高，但低于VC(P<0.05)，酰化前后天竺葵素對(duì)DPPH自由基具有相當(dāng)?shù)那宄Ч?，說明酰化未影響天竺葵素對(duì)DPHH自由基的清除能力。

圖8 天竺葵素對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.8 Pelargonidin removal rate of DPPH radicals

2.7.3 對(duì)ABTS自由基清除的效果

如圖9所示，?；祗每?、未?；祗每睾蚔C均對(duì)ABTS自由基具有明顯清除作用，當(dāng)濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)ABTS自由基的清除率均隨著濃度的增加而增加，同等濃度下VC對(duì)ABTS的清除率高于天竺葵素，當(dāng)濃度達(dá)到0.8 mg/mL后，VC對(duì)ABTS自由基清除幾乎達(dá)到飽和，1 mg/mL天竺葵素對(duì)ABTS自由基清除率達(dá)75.2%，?；昂筇祗每貙?duì)ABTS自由基的清除率無顯著性差異，說明?；⑽从绊懱祗每貙?duì)ABTS自由基的清除能力。

圖9 天竺葵素對(duì)ABTS自由基的清除率Fig.9 Pelargonidin removal rate for ABTS radicals

3 結(jié)論

通過對(duì)胭脂蘿卜天竺葵素的穩(wěn)定性進(jìn)行探究，研究表明天竺葵素的穩(wěn)定性在一定范圍內(nèi)與光照、溫度呈反相關(guān)，氧化劑、金屬離子、pH對(duì)其穩(wěn)定性也有較大影響。采用水楊酸為?；瘎瑢?duì)胭脂蘿卜天竺葵素進(jìn)行?；l(fā)現(xiàn)?；祗每卦跍囟雀哂?0 ℃，光照2天、增加Al3+及不同的pH條件下，穩(wěn)定性均高于未?；祗每?，?；c未酰化天竺葵素對(duì)Fe2+、Mg2+和Zn2+以及H2O2無顯著影響。說明?；沟闷淠透邷?、耐光性能有了較大的改良，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)過程中的溫度及光照有更好的耐受性。

研究還對(duì)?；拔歹；祗每剡M(jìn)行各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)測(cè)定，分析水楊酸?；瘜?duì)天竺葵素的體外抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)酰化天竺葵素對(duì)羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力與未?；祗每?zé)o顯著差異，表明水楊酸?；祗每氐姆€(wěn)定性優(yōu)于未經(jīng)修飾的天竺葵素，且對(duì)其抗氧化活性無影響影響，有較高的開發(fā)應(yīng)用和研究價(jià)值，其機(jī)理及應(yīng)用技術(shù)還需進(jìn)一步研究。