羅 婷，王佳琪，江宇勤，范順明，張春玲，余凌英

成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611137

黃柏為蕓香科植物黃皮樹(shù)PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹(shù)皮，習(xí)稱川黃柏[1]。其主要成分有小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、巴馬汀、藥根堿等生物堿類[2]。黃柏炭炮制品，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡的功效，但黃柏炭清濕熱之中兼有澀性，多用于便血，崩漏下血，在全國(guó)炮制規(guī)范和各地炮制規(guī)范均有收載[3-5]。2015年版《中國(guó)藥典》以小檗堿，黃柏堿作為黃柏質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，尚不能反映黃柏炭的質(zhì)量，且黃柏制炭后各類成分含量均有所變化，巴馬汀成分幾乎消失殆盡，含量最高的小檗堿部分轉(zhuǎn)化為分解產(chǎn)物小檗紅堿[6]。木蘭花堿和小檗紅堿是黃柏炭中的重要成分，應(yīng)同時(shí)作為質(zhì)量控制指標(biāo)才更具有合理性。本實(shí)驗(yàn)以小檗堿為內(nèi)參物，得出黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿與小檗堿的相對(duì)校正因子，建立快捷、方便、全面、實(shí)用的一測(cè)多評(píng)法[7-10]，并對(duì)不同產(chǎn)地飲片進(jìn)行質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030C島津高效液相色譜儀(日本島津公司)；Sartorius BS110S 十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；KQ-300E 超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

黃柏堿對(duì)照品(批號(hào)wkq18051608，四川省維克奇生物科技有限公司)；木蘭花堿(批號(hào)wkq16050801，四川省維克奇生物科技有限公司)；小檗堿對(duì)照品(批號(hào)110713-201613，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；小檗紅堿(批號(hào)wkq16061402，四川省維克奇生物科技有限公司)均為純度達(dá)到98%以上，可供含量測(cè)定用；其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用的30批黃柏炭樣品信息表見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為SHIMADZU InertSustain-C18(4.6 × 250 mm，5 μm)；乙腈(A)-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(B)溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫：0～15 min，10%～14%A；15～35 min，14%～32%A；35～50 min，32%～40%A。進(jìn)樣體積為5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為35 ℃；流速0.8 mL/min。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿適量，分別制成濃度為23.5、30.5、102.4、125.6 μg/mL的對(duì)照品溶液，混合對(duì)照品及飲片樣品圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液(A)和樣品HPLC圖譜(B)Fig.1 HPLC of reference substances (A) and samples (B)注：1黃柏堿；2木蘭花堿；3小檗紅堿；4小檗堿。Note:1 phellodendrine;2 magnolia;3 berberubine;4 berberine.

2.3 供試品溶液的制備

取黃柏炭樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”下的混合對(duì)照品溶液0.5、0.8、1、2、5、10 mL置10 mL容量瓶中定容，制得6種不同濃度的混合對(duì)照品溶液。按照“2.1”下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)做回歸曲線方程，各成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液各5 μL，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定4種對(duì)照品各自的峰面積，結(jié)果黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿峰面積RSD值分別為1.21%、0.54%、0.98%、1.18%表明儀器精密度良好。

表2 4種黃柏炭生物堿成分的線性關(guān)系考察

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液(S1)，分別于0、3、6、12、24、48 h進(jìn)樣5μL，測(cè)定并記錄峰面積。結(jié)果黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿RSD分別為1.72%、1.86%、1.09%、1.53%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批樣品6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，在“2.3”色譜條件下進(jìn)行測(cè)定并記錄峰面積。計(jì)算得到黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿的RSD分別為0.58%、1.61%、1.09%、0.84%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取6份已知含量的樣品0.2 g，精密稱定，按加入的樣品中黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿的含量比對(duì)照品含量比例為1∶1，分別精密加入對(duì)照品溶液。按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果表明黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿平均加樣回收率分別為98.3%、100.5%、99.8%、102%，RSD分別為2.04%、1.58%、2.12%、1.28%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好(見(jiàn)表3)。

表3 加樣回收率計(jì)算結(jié)果(n=6)

3 相對(duì)校正因子計(jì)算及耐用性考察

3.1 相對(duì)校正因子計(jì)算

取混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、20 μL，按公式fk/m=fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak)[11]，式中Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量或濃度，Am為其他組分m的峰面積，Wm為其他組分的質(zhì)量或濃度。以小檗堿為內(nèi)參物，計(jì)算黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿的校正因子。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 黃柏炭3種生物堿成分相對(duì)校正因子

3.2 待測(cè)組份色譜峰定位

利用4個(gè)成分色譜行為的不同，以小檗堿為基準(zhǔn)峰，計(jì)算各個(gè)成分的相對(duì)保留值、保留時(shí)間差，確定其在色譜圖中的位置。結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，相對(duì)保留值RSD ≤ 5%，保留時(shí)間差差異較小。通過(guò)相對(duì)保留值可準(zhǔn)確判斷目標(biāo)峰的準(zhǔn)確峰位置。

表5 黃柏炭3種生物堿成分相對(duì)保留值和保留時(shí)間差

3.3 考察不同色譜柱及高效液相色譜儀對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的影響

在兩種不同的儀器上考察了3個(gè)品牌色譜柱對(duì)校正因子的影響， 結(jié)果表明：不同品牌色譜柱對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯影響，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同儀器和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

續(xù)表6(Continued Tab.6)

儀器Instrument色譜柱Chromatographic column相對(duì)校正因子Relative correction factor相對(duì)保留值Relative retention valuef(小檗堿/黃柏堿)f(Berberine/Phellodendrine)f(小檗堿/木蘭花堿)f(Berberine/Magnolia)f(小檗堿/小檗紅堿)f(Berberine/Berberubine)T(小檗堿/黃柏堿)T(Berberine/Phellodendrine)T(小檗堿/木蘭花堿)T(Berberine/Magnolia)T(小檗堿/小檗紅堿)T(Berberine/Berberubine)Angilent1260InertSustain0.336 00.311 00.978 30.489 00.506 40.931 2Global Chromatagraphy0.348 90.307 90.965 90.516 50.511 40.908 3Kromasil0.328 10.309 81.010 90.469 30.508 40.942 2平均值A(chǔ)verage0.336 60.310 50.986 60.488 70.509 40.940 9RSD%2.271.072.773.671.563.06

3.4 考察不同柱溫、波長(zhǎng)、流速對(duì)校正因子的影響

在同一色譜條件下，考察25、30、35 ℃三個(gè)柱溫、215、230、245 nm 三個(gè)波長(zhǎng)、考察0.6、0.8、1 mL/min三個(gè)體積流量對(duì)校正因子的影響，由表5可知柱溫、波長(zhǎng)、流速的變化對(duì)相對(duì)校正因子的影響不大。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響

4 不同產(chǎn)地黃柏炭測(cè)定結(jié)果

按供“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品，分別精密吸取供試品溶液各5 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定。采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法分別測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表8。

測(cè)定結(jié)果表明，外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法測(cè)得的含量無(wú)明顯差異，說(shuō)明該方法測(cè)定結(jié)果具有較高可信度。不同產(chǎn)地黃柏經(jīng)炭制后4種生物堿成分含量具有明顯的區(qū)別，其中滎經(jīng)縣的黃柏炭炮制品成分含量相對(duì)較高。

5 結(jié)論

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃柏經(jīng)炒炭后有21種化學(xué)成分在炮制前后具有明顯的差異[12]。因此單一成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)不夠全面。黃柏在炒炭過(guò)程中，隨著炮制時(shí)間延長(zhǎng)，小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減少，而小檗紅堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，據(jù)此推測(cè)，小檗堿在加熱過(guò)程中可脫去一個(gè)甲基轉(zhuǎn)變?yōu)樾￠藜t堿[13]，且小檗紅堿在4種生物堿含量中僅次于小檗堿，因此增加其作為一測(cè)多評(píng)法測(cè)定指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)引入一測(cè)多評(píng)法，實(shí)現(xiàn)黃柏炭4種生物堿成分的同時(shí)測(cè)定，對(duì)現(xiàn)有質(zhì)量控制方法進(jìn)行提升，使其更快捷、方便、全面。

表8 不同地區(qū)黃柏炭4種生物堿測(cè)定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)考察了不同柱溫、流速、色譜柱、液相色譜系統(tǒng)對(duì)小檗堿與黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿之間相對(duì)校正因子的影響，驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法在黃柏炭質(zhì)量控制中的可行性和適應(yīng)性。在不同流速的考察過(guò)程中，3種流速對(duì)于混合對(duì)照品均無(wú)明顯影響，但是黃柏炭樣品中成分較多，不同的流速對(duì)黃柏炭樣品具有較大影響。在對(duì)比了3種流速下黃柏炭樣品峰的基線、分離度、對(duì)稱因子等因素后，最后選擇采用流速0.8 mL/min作為本實(shí)驗(yàn)中HPLC流速。

本實(shí)驗(yàn)選擇的30批黃柏均來(lái)源于四川。四川作為黃柏的主要產(chǎn)區(qū)，在中國(guó)國(guó)內(nèi)的生產(chǎn)和銷售都占有舉足輕重的地位。30批黃柏炭中，以滎經(jīng)縣的黃柏炭炮制程度最好，各成分含量也相對(duì)較高。黃柏炒炭后，外觀性狀和內(nèi)在成分變化明顯，且所購(gòu)黃柏炭飲片也因此難以做到炒炭程度統(tǒng)一，因此對(duì)于炮制工藝參數(shù)的研究也極為重要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)各主要有效成分的精確定量測(cè)定，為黃柏炭質(zhì)量的控制和評(píng)價(jià)提供更好技術(shù)參考，同時(shí)為本課題接下來(lái)進(jìn)一步研究黃柏炭的炮制工藝參數(shù)奠定基礎(chǔ)。