趙 娜，張紅星，謝遠(yuǎn)紅，金君華，賈 宇

北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室食品質(zhì)量與安全北京實驗室 微生態(tài)制劑關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)北京市工程實驗室，北京 102206

紅曲霉(Monascus)是一類小型絲狀腐生真菌，屬子囊菌亞門(Ascomycotina)不整囊菌綱(Plectomycetes)散囊菌目(Eurotiales)紅曲科(Monascaceae)[1]，某些紅曲霉菌株在培養(yǎng)過程中能夠產(chǎn)生生理活性物質(zhì)Monacolin K[2,3]。而Monacolin K是HMG-CoA還原酶的抑制劑，具有降低膽固醇的作用[4,5]。

自 20世紀(jì)70年代末，日本Endo等[6]發(fā)現(xiàn)了紅曲霉代謝產(chǎn)物中降膽固醇活性物質(zhì)Monacolin K 及其類似物，便有力地促進(jìn)了紅曲霉Monacolin K相關(guān)方面的研究與應(yīng)用[7]。Monacolin K屬于聚酮類化合物，具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，因此化學(xué)合成的方法不能應(yīng)用于大規(guī)模的生產(chǎn)[8]，所以采用生物發(fā)酵方法是其工業(yè)生產(chǎn)的主要途徑之一[9]。目前，液態(tài)發(fā)酵Monacolin K具有規(guī)模大，自動化程度高，人力成本低，生產(chǎn)過程易控制等顯著優(yōu)點[10]，但由于液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量低，故需在高產(chǎn)Monacolin K菌株的篩選和工藝優(yōu)化上取得突破[11]。本實驗從天然發(fā)酵的紅曲米中分離30株紅曲霉菌，篩選得到高產(chǎn)Monacolin K菌株，采用正交試驗法優(yōu)化發(fā)酵工藝，以期為高產(chǎn)Monacolin K的紅曲霉微生物發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

從天然發(fā)酵的紅曲米中分離的30株紅曲霉菌株，編號見表2。

1.1.2 主要試劑

酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏，均為生物制劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、蔗糖、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉，北京暢華志誠技有限公司；米粉，寧波市江北五橋糧油有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)，北京陸橋技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈，均為色譜純，F(xiàn)isher公司；Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品，青島普瑞邦生物工程有限公司；Taq 聚合酶，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(takara中國)；真菌基因組DNA快速抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基(L)[12]：米粉30 g，葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，NaNO32 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.5 g，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(L)[12]：葡萄糖70 g，牛肉膏15 g，NaNO32 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.5 g，pH自然。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BSA2202S型電子天平，賽多利斯工業(yè)稱重設(shè)備(北京)有限公司；DL-CJ-2ND1型潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；MLS-3750型立式壓力蒸汽滅菌鍋，日本三洋電器股份有限公司；THZ-C型恒溫振蕩器，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；DYY-6D型電泳儀，WD-9413B凝膠成像分析儀，均為北京六一生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲霉菌株的篩選

將采樣自福建地區(qū)的天然發(fā)酵的紅曲米磨碎，以接種環(huán)蘸取少量紅曲米接種于PDA培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行連續(xù)多次劃線分離，直到產(chǎn)生早期為白色、后期為紅色或紫色的單菌落，再用PDA固體培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，將所獲菌株編號，編號見表2，置4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 發(fā)酵液Monacolin K產(chǎn)量測定

將所篩菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)6 天。種子液制備：100 mL三角瓶裝入種子培養(yǎng)基50 mL，接種0.5 cm×0.5 cm大小的菌塊，八層紗布包扎，28 ℃、160 rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3 天。液體發(fā)酵培養(yǎng)：100 mL三角瓶裝入發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，按體積分?jǐn)?shù)7%的接種量接種，八層紗布包扎，28 ℃、160 rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 天。

取2 mL發(fā)酵液于50 mL的離心管中，加入8 mL無水甲醇?；靹蚍胖糜趽u床中160 rpm震蕩提取3 h，5 000 rpm離心10 min取上清[13]， 用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后通過高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)進(jìn)行Monacolin K產(chǎn)量測定[14]。

HPLC檢測條件，色譜柱ZORBAX300SB-C18：柱長150 mm；內(nèi)徑4.6 mm；粒徑5 μm。流動相V(乙腈)∶V(0.01%磷酸)=65∶35；檢測波長237 nm；進(jìn)樣體積20 μL；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃。

1.3.3 菌株Monacolin K產(chǎn)量穩(wěn)定性研究

將高產(chǎn)Monacolin K的優(yōu)勢菌株作為目的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)10代，通過測定每一代發(fā)酵液的Monacolin K產(chǎn)量分析其穩(wěn)定性，測定方法同上。

1.3.4 菌株鑒定

將目的菌株接種于PDA平板上培養(yǎng)7 天，觀察目的菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)。采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取紅曲霉基因組DNA[15]，采用PCR方法擴(kuò)增ITS rDNA基因，引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，PCR反應(yīng)體系見表1。

表1 紅曲霉菌株P(guān)CR反應(yīng)體系

PCR循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min[16]。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST對比分析。將目的菌株送至中國科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行微生物菌種鑒定。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

以發(fā)酵液Monacolin K產(chǎn)量為評價指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗，發(fā)酵培養(yǎng)基配方同上，并設(shè)定初始培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度為28 ℃，初始pH值自然，接種量為體積分?jǐn)?shù)7%，發(fā)酵時間為7 天。對發(fā)酵培養(yǎng)的主要影響因素(接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、初始pH)進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗[17]，接種量分別設(shè)定為體積分?jǐn)?shù)6%、7%、8%、9%、10%；發(fā)酵溫度設(shè)定為24、26、28、30、32 ℃；發(fā)酵時間分別設(shè)定為6、8、10、12、14 天；初始pH值設(shè)定為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。測定各條件下發(fā)酵液中Monacolin K的產(chǎn)量，每個實驗重復(fù)3次。

在此單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計正交試驗方案如表4。

2 研究結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)Monacolin K紅曲霉菌株篩選

將PDA平板上分批次分離的30株紅曲霉菌株，分別標(biāo)記菌株代號為ZX1、ZX2…ZX30。分別對30株紅曲霉進(jìn)行產(chǎn)Monacolin K能力檢測試驗。結(jié)果如表2所示，有9株紅曲霉的發(fā)酵液在檢測波長237nm處有特征吸收峰，說明具有產(chǎn)Monacolin K的能力；其余21株沒有特征吸收峰，可初步判斷這些菌株不產(chǎn)Monacolin K。9株紅曲霉產(chǎn)Monacolin K能力差異較大，其中編號ZX26菌株產(chǎn)Monacolin K能力最強(qiáng)，達(dá)到101.60 mg/L，故在后繼發(fā)酵條件優(yōu)化中選擇編號ZX26為目標(biāo)菌株。

表2 紅曲霉菌株Monacolin K產(chǎn)量

2.2 紅曲霉ZX26 Monacolin K產(chǎn)量穩(wěn)定性

將編號為ZX26菌株傳代培養(yǎng)，進(jìn)行產(chǎn)Monacolin K穩(wěn)定性試驗，通過測定每一代發(fā)酵液的Monacolin K質(zhì)量濃度，來判斷產(chǎn)Monacolin K穩(wěn)定性。結(jié)果如表3所示。

表3 紅曲霉ZX26產(chǎn)Monacolin K穩(wěn)定性(連續(xù)培養(yǎng)10代)

結(jié)果表明，紅曲霉ZX26菌株連續(xù)培養(yǎng)10代后，其Monacolin K產(chǎn)量仍然處于較高水平，可以基本判斷ZX26菌株在產(chǎn)Monacolin K能力方面具有良好的穩(wěn)定性。

2.3 ZX26菌株的形態(tài)學(xué)鑒定與分子學(xué)鑒定

2.3.1 ZX26菌株的菌落形態(tài)及顯微特征

將編號為ZX26菌株接種于在PDA平板培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7天，直徑5 cm，紫紅色，絨毛狀，皺裂(圖1a)，反面紫紅色。菌絲具隔膜，多分枝，直徑3～6 μm。閉囊殼球形，直徑25～50 μm(圖1b)，橙紅色至紫紅色。子囊孢子橢圓形，5～6×4～5 μm。分生孢子著生于孢梗頂端，單個或成串，近球形或倒梨形，8～11×6～8 μm(圖1c)。

2.3.2 ZX26菌株的分子測序結(jié)果

將編號為ZX26菌株ITS rDNA 基因PCR擴(kuò)增后的結(jié)果送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行ITS測序，得到了大小為571bp的序列。在NCBI 中檢索與該菌株序列相似性較高的菌株，結(jié)果表明ZX26菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中紅曲霉菌株同源性高達(dá)98%～99%。進(jìn)化性分析表明(圖2)，紅曲霉ZX26與Monascuspurpureusstrain FRR 1596親緣關(guān)系最近，因此并將其命名為紫紅曲霉ZX26(MonascuspurpureusZX26)，且經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行微生物菌種鑒定，此菌株為紫紅曲霉(Monascuspurpureus)，并于2018年07月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.15992。

圖1 菌株ZX26 形態(tài)學(xué)鑒定Fig.1 Morphological identification of strain ZX26

2.4 單因素培養(yǎng)條件確定

2.4.1 接種量的確定

不同接種量對紫紅曲霉ZX26的影響結(jié)果如圖3所示，接種量在體積分?jǐn)?shù)7%～9%時，有利于Monacolin K產(chǎn)量增加，在體積分?jǐn)?shù)為7%的接種量時Monacolin K產(chǎn)量最高，為101.62 mg/L。當(dāng)接種量大于體積分?jǐn)?shù)9%時，Monacolin K產(chǎn)量開始下降。分析由于隨著接種量的增加，菌體繁殖速度加快，Monacolin K的產(chǎn)量也相應(yīng)增加，但當(dāng)接種量過高，菌體需要的能量大于培養(yǎng)基能提供的能量時，由于營養(yǎng)物質(zhì)匱乏導(dǎo)致紫紅曲霉ZX26生命活力下降，故Monacolin K的產(chǎn)量也相應(yīng)減少。

2.4.2 發(fā)酵溫度的確定

不同發(fā)酵溫度對紫紅曲霉ZX26的影響結(jié)果如圖4所示，隨著發(fā)酵溫度的提高，Monacolin K產(chǎn)量增加，在30 ℃時Monacolin K產(chǎn)量達(dá)到最大值，為111.47 mg/L，隨后隨著溫度的升高，Monacolin K產(chǎn)量開始下降。分析由于菌體對溫度較為敏感，溫度過高或過低都會使Monacolin K產(chǎn)量降低。

圖2 基于菌株ZX26 的ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZX26 based on ITS sequences

圖3 不同接種量下Monacolin K的產(chǎn)量Fig.3 The effects of different inoculum on Monaeolin K production

圖4 不同發(fā)酵溫度對Monacolin K 產(chǎn)量的影響Fig.4 The effects of different temperature on Monaeolin K production

2.4.3 發(fā)酵時間對Monacolin K產(chǎn)量的影響

不同發(fā)酵時間對紫紅曲霉ZX26的影響結(jié)果如圖5所示，隨著發(fā)酵時間的增加，Monacolin K產(chǎn)量也隨之增加。在14 天時Monacolin K產(chǎn)量達(dá)到峰值為100.30 mg/L，但是,相對比10 天時，Monacolin K產(chǎn)量僅增加了0.63 mg/L，結(jié)合實際分析，故認(rèn)為最佳生長時間為10天。推測是因為在發(fā)酵初期，培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)充裕，菌體大量繁殖，故Monacolin K產(chǎn)量增加。后期培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)減少，同時菌體處于衰亡期，菌體數(shù)量開始減少，故產(chǎn)生Monacolin K的產(chǎn)量也相應(yīng)減少。

圖5 不同發(fā)酵時間對Monacolin K 產(chǎn)量的影響Fig.5 The effects of different fermentation time on Monaeolin K production

圖6 不同初始pH對Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.6 The effects of different potential of hydrogen on Monaeolin K production

2.4.4 初始pH對Monacolin K產(chǎn)量的影響

初始pH對紫紅曲霉ZX26的影響結(jié)果如圖6所示，Monacolin K產(chǎn)量在初始pH 4～6范圍內(nèi)較為理想。當(dāng)發(fā)酵液的初始pH為4.0時，Monacolin K產(chǎn)量達(dá)到峰值為87.5 mg/L。當(dāng)發(fā)酵液pH大于5.0時，Monacolin K產(chǎn)量急劇下降。

2.5 正交試驗結(jié)果

為了更加方便快捷的確定各因素對Monacolin K產(chǎn)量的影響，以接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、初始pH值設(shè)計了單因素試驗并結(jié)合單因素試驗的結(jié)果，設(shè)計四因素三水平正交試驗L9(34)。試驗設(shè)計如表4，試驗結(jié)果如表5。

表4 不同元素水平

表5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析

結(jié)果所示，極差R值大小順序為：RB>RD>RA>RC，說明發(fā)酵溫度是Monacolin K產(chǎn)量最顯著的影響因素。K值分析結(jié)果顯示，4個因素的最優(yōu)組合為A1B1C3D3，即接種量為體積分?jǐn)?shù)7%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時間為10天，初始pH值為4.0。根據(jù)此組合進(jìn)行發(fā)酵試驗驗證(設(shè)置3個平行組)，得出最終Monacolin K產(chǎn)量271.36 mg/L，高于正交試驗中所有的組合結(jié)果，說明該組合確實為最佳發(fā)酵條件。

3 結(jié)論

本文從高產(chǎn)Monacolin K的紅曲霉菌株篩選出發(fā)，獲得一株Monacolin K產(chǎn)量較高的紫紅曲霉ZX26菌株，并對培養(yǎng)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。獲得結(jié)論為，在培養(yǎng)基組分為葡萄糖70 g/L，牛肉膏15 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.5 g/L下其最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種量為體積分?jǐn)?shù)7%，發(fā)酵溫度為30 ℃，初始pH值為4.0，發(fā)酵時間為10 天。在此條件下，紫紅曲霉ZX26發(fā)酵液中Monacolin K產(chǎn)量達(dá)271.36 mg/L，相對于培養(yǎng)條件優(yōu)化前Monacolin K產(chǎn)量提高152.19%，經(jīng)驗證此培養(yǎng)條件下Monacolin K產(chǎn)量最佳。通過實驗為紫紅曲中Monacolin K的進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)。