宋志姣，湯 丹，李 悅，章金龍，羅旺全，項 輝，馬前濤

保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，保山 678000

多糖類化合物是真菌、動物、植物細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的主要成分，研究表明這種高分子聚合物在免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、抗病毒、抗氧化等方面均有顯著生物活性[1-3]。多糖類藥物毒副作用小、生物活性隨著純度的提高而顯著增加[4]，我國已有茯苓多糖(國藥準(zhǔn)字B20050015)等多糖類藥物問市。目前，真菌多糖是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，對藥用植物多糖成分的研究較少[5]。對于富含多糖的小白及，其研究主要集中在內(nèi)生菌[6]、組織培養(yǎng)與快速繁殖[7]、白及屬植物鑒定[8]等幾個方面。蔡錦源對同屬白及Bletillastriata(Thunb.ex A.Murray) Rchb.f.的研究認(rèn)為：白及多糖和真菌多糖一樣具有較好的抗氧化能力[9,10]。

小白及Bletillaformosana(Hayata) Schltr.又名小白芨、三叉白及，是蘭科(Orchidaceae)白及屬(Bletilla)多年生草本植物[11]，以干燥假鱗莖入藥，具有消腫止血、收斂和生肌的功效[12]。小白及廣泛分布于我國西南各省區(qū)，歷來為少數(shù)民族重要的習(xí)用藥材[13]，其適應(yīng)能力強(qiáng)、抗逆性好，是易于進(jìn)行林-藥復(fù)合經(jīng)營的藥用植物；植株形態(tài)優(yōu)美、花色艷麗，是美麗鄉(xiāng)村建設(shè)的潛在園林園藝植物?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明小白及含有豐富的白及膠，其中的多糖、聯(lián)芐類、二氫菲類等是小白及主要藥用活性成分[14-16]。本研究以多糖得率為指標(biāo)，探索微波輔助提取小白及假鱗莖多糖的最佳工藝，并比較3種脫蛋白工藝的效果；初步考察小白及粗多糖和精制多糖的抗氧化活性。研究結(jié)果為小白及多糖為主要活性成分的藥品和天然食品添加劑的研究應(yīng)用提供參考，為富含多糖藥用植物的綜合利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小白及：購于保山市隆陽區(qū)農(nóng)民街藥材市場，樣品經(jīng)過保山學(xué)院汪建云教授、保山中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)院楊發(fā)建、廣西大學(xué)蒙奕奕博士共同鑒定。

無水乙醇、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清蛋白、苯酚、考馬斯亮藍(lán)、維生素C、鐵氫化鉀、DPPH、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、濃硫酸、正丁醇、氯仿、磷酸鹽緩沖液、鐵氫化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、Tris-HCl緩沖溶液、鄰苯三酚、濃鹽酸、茯苓多糖(國藥準(zhǔn)字B20050015，湖南補(bǔ)天藥業(yè)有限公司)、胰蛋白酶(酶活力為10 000 U/g，和氏璧生物科技有限公司)等。

1.2 儀器

DHG 9140A烘箱(上海恒一有限公司)、FF-1000A粉碎機(jī)(常州市偉嘉儀器制造有限公司)、CP214電子天平(奧豪斯儀器有限公司)、G70F20N2L-DG微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司)、HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(上海子華生物科技有限公司)、OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海泉杰儀器有限公司)、TDL 5A離心機(jī)(上海安亭)、UV2600紫外-可見分光光度計(日本島津)、20目標(biāo)準(zhǔn)篩(浙江上虞市道墟五四儀器廠)、YCD-DL259電冰箱(中科美菱低溫科技有限公司)、三角瓶、容量瓶等。

1.3 試驗方法

1.3.1 小白及多糖提取條件研究

材料預(yù)處理：小白及假鱗莖洗凈、切片、烘干、粉碎，過20目標(biāo)準(zhǔn)篩后密封備用。單因素實(shí)驗：精確稱取小白及粉末2.000 0 g，置于100 mL三角瓶中，按料液比1∶20(m∶v，g/mL，下同)加入50 ℃溫水，其余4個因素設(shè)定為微波額定功率700 W的40%，微波時間為60 s，浸提溫度80 ℃，浸提時間2 h，固定其中3個因素，依次對微波額定功率700 W的不同百分比(20%、40%、60%、80%、100%)、微波時間(30、40、50、60、70 s)、浸提溫度(50、60、70、80、90 ℃)、浸提時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)進(jìn)行單因素實(shí)驗，提取并浸提3次，參考楊翠嫻[17]的方法合并、濃縮、沉淀和離心提取物，將離心后所得多糖烘干至恒重，采用稱質(zhì)量法測定小白及多糖的得率，重復(fù)3次。

按照下式計算多糖得率：

多糖得率(%)=(多糖干品質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100%

最優(yōu)工藝條件正交試驗：結(jié)合單因素實(shí)驗結(jié)果，參考L9(34)正交試驗表進(jìn)行正交試驗，正交試驗因素及水平如表1，其余步驟相同。

1.3.2 粗多糖脫蛋白工藝研究

1.3.2.1 脫蛋白工藝

Sevag法脫蛋白工藝參考王琳煒[18]。酶法脫蛋白工藝依次對不同水平的酶解溫度(20、30、40、50、60 ℃)、酶加量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL)、酶解時間(30、40、50、60、70 min)進(jìn)行單因?qū)嶒?，酶解后置沸水浴滅?0 min，常溫下離心10 min，5 000 rpm后取上清液測定蛋白含量，探討不同脫蛋白參數(shù)對小白及粗多糖蛋白脫除率及多糖損失率的影響[18]；結(jié)合單因素實(shí)驗的結(jié)果進(jìn)行正交試驗探討最佳脫蛋白工藝。酶-Sevag法聯(lián)用脫蛋白工藝在酶法所得最優(yōu)條件下進(jìn)行，離心后的上清液采用Sevag法進(jìn)行重復(fù)多次脫蛋白，直至無明顯沉淀，測定蛋白質(zhì)和多糖的吸光度。

表1 正交試驗因素及水平

1.3.2.2 蛋白脫除率和多糖損失率測定

參考文獻(xiàn)[18]的方法測定蛋白脫除率，于595 nm波長處測定濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液吸光度(A595nm)，以牛血清白蛋白溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，A595 nm為縱坐標(biāo)，得一元線性回歸方程：Y=17.943X+0.000 5，R2=0.995 9。

蛋白質(zhì)脫除率按下式計算：

蛋白質(zhì)脫除率(%)=(Ri-Rj)/Ri×100%

式中：Ri、Rj分別代表所得小白及粗多糖脫蛋白前、后蛋白質(zhì)含量(mg/mL)。

參考文獻(xiàn)[18]的方法測定多糖損失率，于490 nm波長處測定濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液吸光度(A490 nm)，以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，A490 nm為縱坐標(biāo)，得一元線性回歸方程：Y=10.48X，R2=0.999 1。

多糖損失率按下式計算：

多糖損失率(%)=(Ti-Tj)/Ti×100%

式中：Ti、Tj分別代表所得小白及粗多糖脫蛋白前、后多糖含量(mg/mL)。

1.3.3 多糖抗氧化性研究

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016繪制圖表，用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助提取小白及多糖

2.1.1 微波功率

測定結(jié)果表明，在微波功率小于額定功率的40%時，多糖得率隨額定功率百分比的增加而增大；微波功率為額定功率的40%時，多糖得率最大，此時多糖得率為32.50%。微波會使分子的熱運(yùn)動增加，破碎細(xì)胞壁，在較短時間內(nèi)使小白及多糖溶出。當(dāng)微波額定功率大于40%時，多糖得率顯著下降，這可能是由于微波不斷增強(qiáng)，部分多糖因過度加熱而分解，同時雜質(zhì)溶出增多，在進(jìn)行醇沉?xí)r小分子糖溶解在95%的乙醇溶液中，從而降低了小白及多糖得率[18]。

圖1 額定功率百分比對小白及多糖得率的影響Fig.1 Effect of microwave power percentage on extraction yield of polysaccharide

圖2 微波時間對小白及多糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave time on extraction yield of polysaccharide

2.1.2 微波時間

微波時間小于40 s時，多糖得率與微波時間呈正比，可能是在提取初期，濃度梯度差大，多糖擴(kuò)散速率快。微波時間為40～60 s，多糖得率變化緩慢，當(dāng)微波時間為60 s時，多糖得率最大，為36.17%，可能是濃度梯度差減小，擴(kuò)散減慢。微波時間大于60 s，多糖得率顯著下降，可能是過分加熱導(dǎo)致部分多糖水解加大，使多糖得率下降[17]。

2.1.3 浸提溫度

浸提溫度小于70 ℃，多糖得率與溫度呈正比；當(dāng)浸提溫度為70 ℃時，多糖得率達(dá)到最大值，為25.33%；浸提溫度大于70 ℃，多糖得率顯著下降，其原因可能是溫度過高造成多糖的降解，溫度70 ℃為最佳提取溫度。

圖3 浸提溫度對小白及多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharide

2.1.4 浸提時間

當(dāng)浸提時間小于2.0 h時，多糖得率隨浸提時間的增大而增大，當(dāng)浸提時間為2.0 h時，多糖得率達(dá)到最大值，為30.5%；當(dāng)浸提時間大于2.0 h時，多糖得率顯著下降，其原因可能是長時間浸提使材料糊化，多糖難溶出，故浸提時間2.0 h為最佳。

圖4 浸提時間對小白及多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharide

2.1.5 正交試驗優(yōu)化微波輔助提取小白及多糖工藝

正交試驗的結(jié)果表明，工藝為A2B1C2D3的提取方案小白及多糖得率最高，但是從極差分析的結(jié)果來看小白及多糖提取的最佳工藝應(yīng)為：A2B2C2D3。在相同條件下對A2B1C2D3和A2B2C2D3分別進(jìn)行3次重復(fù)提取實(shí)驗以驗證結(jié)果，表明小白及多糖的平均得率分別為37.67%和38.33%，綜上所述微波輔助提取小白及多糖的最佳工藝組合為A2B2C2D3，即微波功率為額定功率的40%，微波時間60 s，浸提溫度70 ℃，浸提時間2.5 h。

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果

以多糖得率為考察指標(biāo)(表3)，經(jīng)方差分析可得除了A微波額定功率百分比(%)對多糖得率影響顯著以外，B微波時間(s)、C浸提溫度(℃)和D浸提時間(h)對多糖得率的影響并不顯著，根據(jù)顯著性可得影響小白及多糖得率的因素順序為A>D>B>C，即微波額定功率百分比>浸提時間>微波時間>浸提溫度。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析

2.2 小白及多糖脫蛋白工藝分析

2.2.1 Sevag法脫蛋白結(jié)果分析

小白及粗多糖的蛋白脫除率和多糖損失率隨著脫蛋白次數(shù)的增加，均呈上升趨勢。在第8次處理之后，小白及粗多糖的蛋白質(zhì)脫除率為81.73%，多糖損失率達(dá)31.73%，采用該方法脫去小白及粗多糖中蛋白質(zhì)的同時，蛋白質(zhì)的脫除伴隨著多糖的損失。

圖5 Sevag法脫小白及粗多糖蛋白Fig.5 Efficiency of protein removal by the Sevag method

2.2.2 酶法脫蛋白結(jié)果分析

單因素實(shí)驗結(jié)果表明在底物濃度、催化作用接觸面積一定的情況下，蛋白質(zhì)脫除反應(yīng)不會一直隨著酶濃度、酶解時間、酶解溫度的增加而增加，酶加量0.5 mL，酶解時間40 min，酶解溫度40 ℃的條件下蛋白脫除率最高，在最優(yōu)單因素條件下小白及粗多糖的蛋白脫除率分別為65.59%、63.43%和67.23%。正交試驗結(jié)果表明：最佳工藝實(shí)驗號為6，既A2B3C1D2，但是從極差分析的結(jié)果來看小白及多糖提取的最佳工藝應(yīng)為：A2B2C1D3。在相同條件下對A2B3C1D2和A2B2C1D3分別進(jìn)行3次重復(fù)提取實(shí)驗以驗證結(jié)果，兩個工藝的綜合評分分別為72.58%和73.81%，因此酶法脫蛋白的最佳工藝組合為A2B2C1D3，即酶加量0.5 mL，B酶解時間40 min，酶解溫度30 ℃。由極差R分析可知，影響蛋白脫除程度因素按其作用大小排序為B>C>D>A，即酶解時間>酶解溫度>酶添加量。方差分析的結(jié)果表明(未列出)：除了A酶加量(mL)對小白及粗多糖蛋白脫除率影響顯著以外，B酶解時間和C酶解溫度對蛋白脫除率影響并不顯著，根據(jù)顯著性將影響小白及多糖得率的因素順序為B>C>A>D，即酶解時間>酶解溫度>酶添加量。

表4 L9(34)胰蛋白酶脫蛋白法正交試驗結(jié)果

續(xù)表4(Continued Tab.4)

實(shí)驗號CodeA酶加量Enzyme addition (mL)B酶解時間Enzymatic hydroly time (min)C 酶解溫度Enzymatic hydroly temperature (℃)D空Empty蛋白質(zhì)脫除率Protein removal rates (%)多糖保留率Polysaccharide retention rates (%)綜合評分Comprehensive evaluation5223164.5779.8972.236231265.3882.4273.907313262.2777.9470.118321363.8379.6271.739332161.6473.2467.44K168.2569.5471.0969.11K272.3471.0769.9468.77K369.7670.1570.2770.58R4.296.466.265.92最優(yōu)方案A2B2C1D3

2.2.3 酶-Sevag法聯(lián)用脫蛋白結(jié)果分析

由圖6可知，先用酶法處理后蛋白質(zhì)脫除率為65.38%，多糖損失率為17.58%，脫除次數(shù)大于2次以后蛋白質(zhì)脫除率無明顯差異，與之相反多糖損失率仍在增加。因此在第5次處理后停止實(shí)驗，此時蛋白質(zhì)脫除率為81.11%、多糖損失率為33.22%。綜合考慮蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率兩組數(shù)據(jù)，酶-Sevag法處理2次時蛋白脫除率較高為80.01%，多糖損失率較低為24.58%。

2.2.4 三種脫蛋白工藝比較

圖6 酶-Sevag法脫蛋白Fig.6 Deproteinization efficiency of the combined method

表5 三種脫蛋白工藝最佳參數(shù)比較

測定結(jié)果表明：采用Sevag法除去小白及粗多糖中的蛋白質(zhì)，脫除率最高為81.31%，但同時多糖損失率也最高為31.73%；采用酶法除去小白及粗多糖中的蛋白質(zhì)時，蛋白質(zhì)脫除率最低為65.41%，同時多糖損失率也最低為17.78%；采用酶-Sevag法時，蛋白質(zhì)脫除率為80.01%與Sevag法較為接近，同時多糖損失率為24.58%遠(yuǎn)低于Sevag法的31.73%。采用酶-Sevag法脫去小白及粗多糖中的蛋白質(zhì)過程中，胰蛋白酶將粗多糖中的蛋白質(zhì)降解為小分子氨基酸或者多肽，留在溶液中；而分子量較大的多糖則可通過高速離心獲得沉淀；再結(jié)合Sevag法處理2次，既節(jié)約了試劑和時間，又降低了多糖損失率，故酶-Sevag法為小白及粗多糖脫蛋白的最優(yōu)方法。該方法的參數(shù)為：酶加量0.5 mL、酶解溫度40 ℃、酶解時間30 min，后置沸水浴中滅酶10 min，取出后離心，上清液采用Sevag法脫蛋白2次。

2.3 小白及多糖的抗氧化性分析

2.3.1 鐵還原能力分析

如圖7所示，小白及粗多糖、三種方法精制多糖、維生素C和茯苓多糖的鐵還原能力皆隨濃度的增大而增大，相同濃度的小白及粗多糖、三種方法精制多糖和茯苓多糖的鐵還原能力低于維生素C，當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/mL時小白及粗多糖在700 nm的吸光度為0.863，Sevag制多糖的為0.583，酶制多糖的為0.763，酶-Sevag制多糖的為0.723，維生素C的為5.602，茯苓多糖的為0.633。同濃度下小白及多糖的鐵還原能力低于維生素C，除Sevag法所得多糖以外其余精制方式所得小白及多糖略高于茯苓多糖。

圖7 多糖對鐵的還原能力Fig.7 Scavenging effect on ferric reducing antioxidant power

2.3.2 DPPH自由基的清除能力

圖8 多糖DPPH自由基的清除能力Fig.8 Scavenging effect of WSP on DPPH

5 900.083 μg/mL。說明在相同濃度的情況下，酶法小白及多糖對DPPH自由基的清除能力較好、小白及粗多糖次之。

圖9 多糖的清除能力Fig.9 Scavenging effect of WSP on

3 討論

研究采用微波輔助法提取小白及多糖，在最優(yōu)工藝條件下小白及多糖的提取率可達(dá)38.33%，略高于水提醇沉法提取同屬植物白及的粗多糖得率34.7%[22]；所得提取物采用Sevag法進(jìn)行處理時脫蛋白率為81.73%，略高于白及的75.86%[22]。微波輔助提取技術(shù)耗時短、效率高，適用于小白及多糖提取，可為植物多糖提取提供參考。

4 結(jié)論

致謝：本論文得到保山市第八批創(chuàng)新團(tuán)隊，“藥食同源”產(chǎn)品質(zhì)量及品牌建設(shè)研究創(chuàng)新團(tuán)隊項目資助(201911)；本論文得到國家留學(xué)基金資助。