胡居吾，羅 斌，吳 磊，涂招秀，謝 欣

1江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，南昌 330096；2江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，南昌 330001

蔓三七(GynuraProcumbens)，又名平臥菊三七，為多年生草本植物，2012 年 5月被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源普通食品。蔓三七莖葉營(yíng)養(yǎng)豐富，富含粗多糖和綠原酸等成分。民間利用其消炎止咳，通經(jīng)活絡(luò)，消腫止痛，現(xiàn)代生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究證明，蔓三七具有保肝[1]、降壓[2]、調(diào)脂降糖[3]、抗炎鎮(zhèn)痛[4-7]、抗癌[8-10]等多種藥理活性。另一方面，其具有極好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，蔓三七葉是一種藥食兼可的獨(dú)特植物，它和現(xiàn)在人們食用的木耳菜同屬。食味柔滑，清香可口?？汕宄?、涼拌、氽湯，其葉也可生吃，或取鮮葉開(kāi)水沖泡當(dāng)茶飲，是一種高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的“藥食兩用”植物。但是，由于蔓三七葉占整株植物的28%，蔓三七莖占目前68%，這部分作為廢棄物處理，目前還沒(méi)有得到很好利用。

本實(shí)驗(yàn)以水提醇沉法提取蔓三七莖多糖，研究了蔓三七莖多糖的理化性質(zhì)，首次應(yīng)用 GC 分析蔓三七莖多糖的單糖組成；評(píng)價(jià)了蔓三七莖多糖的抗氧化活性(包括總抗氧化能力、DPPH和 OH自由基的清除能力)；最后，初步探討了蔓三七莖多糖對(duì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性，旨在為蔓三七葉的綜合開(kāi)發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓三七莖，江西華紫仁農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，烘干、粉碎后過(guò)20目篩備用。

阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。三氟乙酸、鹽酸羥胺、吡啶、醋酸酐均為分析純，肌醇為生化試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；維生素C(Vc)，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美國(guó)Sigma公司；苯酚、抗壞血酸、水楊酸鈉、三氟乙酸、甲醇、鹽酸羥胺、溴化鉀、硫酸亞鐵、濃硫酸、葡萄糖均為分析純，購(gòu)自綿陽(yáng)市信捷商貿(mào)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀GC-2010(SHIMADZU公司)，檢測(cè)器：FID；色譜柱：WondaCap5毛細(xì)管柱 (0.25 mm×30.0 m×0.25 μm)；自動(dòng)進(jìn)樣器AOC-20S(SHIMADZU公司)；自動(dòng)注射器AOC-20i(SHIMADZU公司)。傅立葉紅外光譜儀FTIR-7600(lambad公司)；壓片機(jī)DF-4型(天津港東科技發(fā)展股份有限公司)；UV-1800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；METTLER-TOLEDOAL104型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q型超純水制備系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DZF-6090Z型真空干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。TGL-16GA CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 蔓三七莖粗多糖(GPSCP)提取工藝流程[11]

取蔓三七葉烘干、粉碎、過(guò)篩，按照一定料液比1∶15加入蒸餾水，于65 ℃恒溫水浴2.5 h，然后采用抽濾方式分離。濾渣部分繼續(xù)用同樣方法浸提，上清液合并濃縮后緩慢加入4倍體積的無(wú)水乙醇沉淀粗多糖，于4 ℃低溫靜置24 h，再以4 800 rpm離心10 min，收集下層粗多糖沉淀，最后用無(wú)水乙醇洗滌2次，得蔓三七粗多糖，測(cè)定的蔓三七葉粗多糖得率。

1.3.2 蔓三七莖多糖(GPSP)純化工藝流程

采用Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)進(jìn)行脫蛋白，重復(fù)操作6次后，溶液體系在旋轉(zhuǎn)于蒸發(fā)儀上(45 ℃，-0.01 MPa)除去殘留的Sevage試劑。再配成10 mg/mL的多糖溶液，裝入截留分子量為3 000 u的透析袋中透析24 h，收集透析袋內(nèi)的多糖溶液，冷凍干燥制得蔓三七莖多糖(GPSP)樣品。

1.3.3 蔓三七莖多糖總糖含量測(cè)定

1.3.3.1 多糖含量的測(cè)定

采用趙會(huì)然的苯酚-硫酸法[21]，體系略作改動(dòng)。在490 nm處的吸光度，得到回歸方程為y=7.55x-0.078，R2=0.999 4，表明總糖在0.021～0.166 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

樣品液按上面步驟得糖濃度，按下式計(jì)算多糖提取量：

多糖提取量(mg/g)=(C×V×N)/1 000M

式中:C—多糖濃度(μg /mL)，V—提取液總體積(mL)，N—稀釋倍數(shù)，M—干粉重量(g)。

1.3.3.2 方法學(xué)考察

1.3.3.2.1 精密度

取0.1 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液，按上述的方法進(jìn)行測(cè)定，平行六份，計(jì)算吸光度的RSD值。

1.3.3.2.2 重復(fù)性

稱(chēng)取六份蔓三七莖粗多糖樣品，分別配制成0.2 mg/mL的供試品溶液，按上述的方法測(cè)定其吸光度，計(jì)算多糖總糖含量的RSD值。

1.3.3.2.3 穩(wěn)定性

精密稱(chēng)取六份蔓三七莖粗多糖樣品，按上述的方法測(cè)定吸光度，每15 min，測(cè)定一次，在2 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，計(jì)算吸光度的RSD值。

1.3.3.2.4 加樣回收率

取已知含量的六份蔓三七莖粗多糖樣品，精密加入等量的無(wú)水葡萄糖，制成供試品溶液，按上述的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。

1.3.4 GPSP中單糖組成(GC分析)[12]

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的制備

精密稱(chēng)取鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖六種單糖標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別放入10 mL具塞試管中，分別往各具塞試管中加入鹽酸羥胺10 mg和內(nèi)標(biāo)8 mg，再分別加入吡啶0.5 mL，蓋上塞子，在振蕩機(jī)上搖勻，然后放入水浴鍋中于90 ℃下加熱反應(yīng)30 min，在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)間歇振蕩。反應(yīng)結(jié)束后，取出后冷卻至室溫，最后往各具塞試管中加入0.5 mL醋酸酐，繼續(xù)放入水浴鍋中于90 ℃下加熱反應(yīng)30 min。取下塞子后于70 ℃水浴中將試管中的溶液蒸發(fā)至干，得到的固體物質(zhì)加入1 mL氯仿震蕩溶解完全后，取樣進(jìn)行氣相色譜分析[15]。

1.3.4.2 多糖的水解和衍生化

多糖的水解：精密稱(chēng)取GPSP樣品50 mg于50 mL旋蒸瓶中，加入4 mol/L的三氟乙酸溶液5 mL，加玻璃塞封口。振蕩使多糖溶解。在100 ℃下水解6 h，取出于70 ℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

多糖的衍生化：水解后的多糖，按照“1.3.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化的方法分別衍生化。

1.3.4.3 氣相色譜分析

氣相色譜條件設(shè)置：氫氣流量40.0 mL/min，空氣流量400 mL/min，氮?dú)獯滴擦髁?0.0 mL/min，進(jìn)樣壓力100.0 kpa；進(jìn)樣溫度為240 ℃，檢測(cè)器溫度為260 ℃，色譜柱初始溫度為140 ℃，維持3 min，以10 ℃ /min升至240 ℃，維持15 min，進(jìn)樣體積為 1 μL。

1.3.4.4 重復(fù)性考察

精密稱(chēng)取6 份GPSP樣品50 mg，按1.3.4.2“多糖的水解和衍生化”項(xiàng)下操作，取1 μL樣進(jìn)行氣相色譜分析，記錄各峰面積，計(jì)算鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的峰面積，RSD分別為：0.98%、1.18%、1.23%、0.89%、1.17%、1.04%。結(jié)果表明本研究方法重復(fù)性良好。

1.3.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、6、8、12、24 h，取1 μL，按“1.3.4.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，峰面積的RSD分別為1.35%、1.46%、2.43%、2.58%、2.64%、1.89%。結(jié)果表明，鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的衍生化產(chǎn)物在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.4.6 單糖組成

按下列公式計(jì)算GPSP中單糖質(zhì)量，并求得相應(yīng)單糖的摩爾數(shù)。

式中m0、mr、ms分別表示待測(cè)單糖、單糖標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量，A0、Ar、As分別表示待測(cè)單糖、單糖標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積，f表示相對(duì)校正因子。

1.3.5 紅外光譜分析[13]

取少量干燥后的GPSP粉末，往其中加入適量的溴化鉀晶體，在紅外燈照射下于瑪瑙研缽中輕輕研磨，至極細(xì)粉末，用壓片機(jī)壓制成透明薄片，經(jīng)顯微紅外光譜儀400 cm-1～4 000 cm-1中紅外區(qū)掃描。

1.3.6 GPSP的抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 總抗氧化能力的測(cè)定[14]

采用總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒測(cè)定GPSP總抗氧化能力。分別準(zhǔn)確配制不同濃度的GPSP和抗壞血酸(Vc)溶液樣品，按照T-AOC測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在520 nm測(cè)定管樣品吸光度(A測(cè)定)和對(duì)照管吸光度(A對(duì)照)，根據(jù)下列公式計(jì)算GPSP及Vc的總抗氧化能力(η總):

式中:

N—反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(反應(yīng)液總量/取樣量)；

n—樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

在37 ℃時(shí)，每分鐘每毫升樣品使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定[15]

分別取不同濃度的GPSP和抗壞血酸(Vc)溶液2 mL，加入2 mL的DPPH乙醇溶液，混勻后室溫放置30 min后，在517 nm處的吸光度(A1)。同時(shí)測(cè)定不加DPPH的多糖溶液與乙醇混合后的吸光度(A2)，不加樣品的DPPH乙醇溶液作為空白對(duì)照的吸光度(A0)。根據(jù)公式計(jì)算GPSP及Vc的DPPH自由基清除率(ηDPPH·):

1.3.6.3 OH自由基清除能力的測(cè)定[16]

取0.5 mL 2 mmol/L水楊酸鈉-乙醇溶液，往其中加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液0.5 mL，再分別加入1.5 mL不同濃度GPSP溶液和抗壞血酸(Vc)溶液，最后加入0.5 mL 6 mmol/L雙氧水。在510 nm下測(cè)定吸光度(Ax)。同時(shí)測(cè)定用蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液的吸光度(Ay)，蒸餾水代替樣品溶液作為空白對(duì)照的吸光度(A0)。根據(jù)下列公式計(jì)算GPSP及VC的OH自由基清除率(η·OH):

1.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)和藥液配制

RAW 264.7 細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。RAW 264.7 細(xì)胞用RPMI 1 640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)在恒溫37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將GPSP溶解于二甲基亞砜試劑(DMSO)中，用RPMI 1 640培養(yǎng)基稀釋成供試液濃度，所配制的藥液中DMSO含量不能超過(guò)0.1%。

1.3.8 細(xì)胞活性檢測(cè)-MTT法

采用MTT法[17]檢測(cè)細(xì)胞存活率。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW 264.7細(xì)胞，按1×106個(gè)/mL、100 μL/孔接種于96孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜后，吸取舊培養(yǎng)基，加入待測(cè)藥物的新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取舊培養(yǎng)基，于每孔中加入MTT工作液100 μL，繼續(xù)孵育3 h后每孔加入MTT終止液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h后，用酶標(biāo)儀在550 nm處測(cè)定OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)存活率。

細(xì)胞的相對(duì)存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組孔吸光值-空白

組孔吸光值)/(實(shí)驗(yàn)組孔吸光值-空白組孔吸光值)

1.3.9 對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO、PEG2和TNF-α分泌的影響[18]

將密度為1×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，洗掉舊培養(yǎng)基，加入不同濃度供試藥物的新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以加入1 μg/mL LPS處理的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照組。檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO的分泌量，按ELISA檢測(cè)試劑盒操作方法測(cè)定TNF-α及PGE2的分泌量。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用Origin 8.0軟件作圖，SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05表示組間有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察及多糖樣品測(cè)定結(jié)果

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖對(duì)照品的吸光度RSD值為1.87%，說(shuō)明本研究采用的UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)精密度良好；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品總糖含量的RSD值為2.35%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性結(jié)果顯示該方法在2 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD值為0.65%；回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加樣回收率范圍96.65%～104.12%，RSD為1.89%。

2.2 GPSP中糖醛酸、硫酸根、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定，蔓三七葉多糖的得率、含量及蔓三七葉多糖中的糖醛酸、硫酸根、蛋白質(zhì)含量見(jiàn)表1。

表1 蔓三七莖多糖(GPSP)的相關(guān)基本成分

與其他提取多糖方法(如堿提法、酶提法)相比，水提醇沉法獲取的糖醛酸及硫酸根含量較低，因?yàn)椋A溶液能使蔓三七莖細(xì)胞壁致密結(jié)構(gòu)變得疏松，打斷了葡萄糖醛酸與半纖維素或纖維素之間分子的連接，從而使糖醛酸溶于稀堿溶液中，故堿提法得到糖醛酸和硫酸根含量最高。酶提法在一定程度上會(huì)破壞纖維素、半纖維素的結(jié)構(gòu)，減少糖醛酸基團(tuán)在溶劑中的暴露，故纖維素酶法得到的糖醛酸含量低于堿法提；水法提取其中的水溶性多糖，故糖醛酸和硫酸根含量均較低。蔓三七莖除含有多糖類(lèi)外，還含有蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等。

2.3 單糖組成

本研究首次采用GC分析鑒定了GPSP的單糖組成，采用鹽酸羥胺肟化和乙酸酐乙?；苌ㄓ行Э朔捎诙嗵堑漠悩?gòu)化而造成的多峰現(xiàn)象，使得每種單糖都能獲得單一的色譜峰，有利于進(jìn)行氣相色譜的定性和定量分析。圖1和圖2表明，GPSP主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖六種單糖組成。其中，木糖含量最大，半乳糖和阿拉伯糖次之，六種單糖的摩爾比為1.69∶4.64∶9.17∶1.00∶1.92∶4.85。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of complex monosaccharide derivative注：1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.木糖；4.甘露糖；5.葡萄糖；6.半乳糖；7.肌醇。Note:1.Rhamnose;2.Arabinose;3.Xylose;4.Mannose;5.Glucose;6.Galactose;7.Inositol.

圖2 GPSP氣相色譜圖Fig.2 GC chromatogram of polysaccharide from Gynura procumbens stem注：1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.木糖；4.甘露糖；5.葡萄糖；6.半乳糖。Note:1.Rhamnose;2.Arabinose;3.Xylose;4.Mannose;5.Glucose;6.Galactose.

2.4 光譜分析

紅外光譜是研究聚合物結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵，表征不同化合物的常用手段之一，具有高度的特征性，一種有效研究分子官能團(tuán)特征的手段。圖3結(jié)果顯示，GPSP在3 409.529 cm-1處出現(xiàn)的寬峰為分子間和分子內(nèi)羥基(O-H)伸縮振動(dòng)特征峰。2 964.053 cm-1處吸峰收為糖鏈中飽和甲基或亞甲基(C-H)伸縮振動(dòng)峰，1 614.126 cm-1處吸峰收為 C=O伸縮振動(dòng)峰。1 398.138 cm-1處吸收峰為C-H的變角振動(dòng)峰。1 043.300 cm-1處吸收峰可能是吡喃糖環(huán)的特征吸收峰[19]。

圖3 GPSP的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of polysaccharide from Gynura procumbens stem

2.5 GPSP的抗氧化活性

2.5.1 總抗氧化能力

不同質(zhì)量濃度GPSP樣品總抗氧化能力研究結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，GPSP的總抗氧化能力隨著溶液濃度增大，抗氧化能力隨之增強(qiáng)，與Vc在不同質(zhì)量濃度的總抗氧化能力走向趨勢(shì)相同。當(dāng)GPSP樣品質(zhì)量濃度為5.00 mg/mL時(shí)，GPSP的總抗氧化能力達(dá)到了11.96±0.50 U/mL，達(dá)到相同質(zhì)量濃度的Vc總抗氧化能力2.65±0.66 U/mL的95.0%以上?？梢钥闯觯珿PSP總抗氧化能力較強(qiáng)。

圖4 GPSP總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capability of polysaccharide from Gynura procumbens stem

2.5.2 對(duì)DPPH自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度GPSP對(duì)DPPH自由基清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。GPSP與Vc的DPPH 自由基清除能力均隨著質(zhì)量濃度增大具有增強(qiáng)趨勢(shì)。各濃度GPSP對(duì)DPPH 自由基清除能力低于同質(zhì)量濃度下Vc對(duì)DPPH 自由基清除能力。但是，各質(zhì)量濃度下的GPSP對(duì)DPPH 自由基清除效果也很明顯，在濃度為4 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH 自由基清除率高達(dá)63.4%±2.36%，在此質(zhì)量濃度下GPSP清除DPPH自由基的IC50為2.76±0.17 mg/mL。說(shuō)明GPSP對(duì)DPPH自由基清除能力較好，盡管GPSP對(duì)DPPH自由基的清除能力低于Vc，但由于其良好的抗氧化活性和無(wú)任何毒性，可開(kāi)發(fā)一種天然的抗氧化劑。

圖5 GPSP對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.5 The scavenging effect on DPPH free radical of polysaccharide from Gynura procumbens stem

2.5.3 對(duì)OH自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度GPSP對(duì)OH自由基清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。GPSP與Vc的OH自由基清除能力均隨著質(zhì)量濃度增大具有增強(qiáng)趨勢(shì)。各濃度GPSP對(duì)OH自由基清除能力低于同質(zhì)量濃度下Vc對(duì)OH自由基清除能力。但是，各質(zhì)量濃度下的GPSP對(duì)OH自由基清除效果也很明顯，在濃度為5 mg/mL時(shí)，GPSP對(duì)OH自由基清除率為68.12%±1.12%，在此質(zhì)量濃度下GPSP清除OH自由基的IC50為1.43±0.11 mg/mL，說(shuō)明GPSP對(duì)OH自由基清除效果較好。

圖6 GPSP對(duì)OH自由基清除能力Fig.6 The scavenging effect on OH free radical of polysaccharide from Gynura procumbens stem

2.6 對(duì)炎癥因子釋放的影響

圖7 GPSP對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率及炎癥因子含量的影響 Fig.7 The effects of GPSP on cells viability and the contents of cytokines secretion in RAW 264.7

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)GPSP在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響，以考察GPSP的安全性。研究結(jié)果如圖7(A)所示，樣品濃度在12.5～100 μg/mL范圍內(nèi)，RAW 264.7細(xì)胞存活率所呈現(xiàn)的趨勢(shì)與空白對(duì)照組相比基本一致，這說(shuō)明GPSP在濃度12.5～100 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞并無(wú)毒性。但是，當(dāng)樣品濃度在200 μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞存活率所呈現(xiàn)的下降趨勢(shì)。

由免疫和非免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子是細(xì)胞間的信號(hào)分子，在免疫反應(yīng)中起到重要的作用。活化的巨噬細(xì)胞能夠釋放大量的細(xì)胞因子(比如NO)。這些炎癥因子在細(xì)胞毒性/抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[20]。因此，本研究中將NO的釋放水平作為免疫刺激中巨噬細(xì)胞活化的指標(biāo)之一。采用Griess試劑法測(cè)定NO的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7(b)所示，正常組中RAW264.7細(xì)胞只釋放少量的NO(3.03±0.11 μM)，隨著加入的GPSP樣品濃度的增加，RAW264.7細(xì)胞釋放NO的含量逐漸增加，并呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性關(guān)系。在GPSP樣品濃度為50.0 μg/mL 時(shí)，NO的分泌量達(dá)到最大(39.28±3.25 μM)。另一方面，在樣品濃度在12.5～100 μg/mL范圍內(nèi)，RAW264.7細(xì)胞釋放NO的含量比LPS組低，說(shuō)明GPSP比LPS更溫和，適合作為免疫調(diào)節(jié)劑。

3 結(jié)論

苯酚-硫酸法是常用的測(cè)定多糖含量的方法，結(jié)果表明該方法重復(fù)性、穩(wěn)定性好。采用氣相色譜法(GC)分析測(cè)定GPSP中單糖組成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，摩爾比為1.69∶4.64∶9.17∶1.00∶1.92∶4.85。該方法具有簡(jiǎn)便靈敏、衍生物雜質(zhì)少、精密度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能準(zhǔn)確測(cè)定出GPSP中單糖的組成，具有較強(qiáng)的適用性。體外抗氧化活性結(jié)果證實(shí)GPSP對(duì)總抗氧化能力、DPPH自由基、OH自由基的清除能力具有較好的清除效果，并表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。

采用MTT法檢測(cè)研究GPSP對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活性的影響時(shí)，在GPSP樣品濃度12.5～100 μg/mL范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率所呈現(xiàn)的趨勢(shì)與空白對(duì)照組相比基本一致，這說(shuō)明GPSP在濃度12.5～100 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞并無(wú)毒性?？傮w而言，蔓三七莖多糖的抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)較強(qiáng)。下一步的研究工作主要集在對(duì)蔓三七莖粗多糖進(jìn)行進(jìn)一步純化，再詳細(xì)探討其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，并使蔓三七莖多糖的免疫功效效果得到更詳實(shí)的數(shù)據(jù)。