結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[1]。大量研究表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及基因表達(dá)過(guò)度、抑癌基因失活、癌基因激活的多步驟、多基因參與的復(fù)雜過(guò)程[2]。目前基因的靶向治療已成為預(yù)防結(jié)直腸癌發(fā)生及降低病死率的一個(gè)重要手段。CST1基因定位于20p11.21染色體，編碼一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin SN，屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族。近年來(lái)大量研究表明，過(guò)度表達(dá)的CST1在惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。如CST1表達(dá)上調(diào)的膀胱移行細(xì)胞癌患者的復(fù)發(fā)率較高[3]，胃癌中CST1基因異常高表達(dá)，RNA干擾其表達(dá)后可降低細(xì)胞增殖[4]。CST1基因在結(jié)直腸癌中的研究較少，有研究表明半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin C與Cystatin SN一樣，也屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族，在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)高于正常對(duì)照組[5]，但CST1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性及機(jī)制尚未明確。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)途徑，與包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。本研究檢測(cè)了不同結(jié)直腸癌細(xì)胞中的CST1表達(dá)，采用RNA干擾抑制其表達(dá)，觀察CST1表達(dá)被抑制后的細(xì)胞活力及侵襲能力，并進(jìn)一步研究其對(duì)STAT3信號(hào)通路的影響，以期為結(jié)直腸癌的診療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑和儀器

正常結(jié)腸NCM460細(xì)胞及人結(jié)直腸癌SW480、HCT116、Caco2和HT29細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、MTT溶液、DMSO均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Transwell侵襲小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司； STAT3、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

NCM460、SW480、HCT116、Caco2和HT29細(xì)胞在37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合密度時(shí)，使用胰酶消化后傳代。實(shí)驗(yàn)取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

1.3 轉(zhuǎn)染

根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)針對(duì)CST1的特異性siRNA(si-CST1組)，同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNA(NC組)，且序列經(jīng)BLAST同源比較分析后顯示與其他人類基因序列無(wú)同源性，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。轉(zhuǎn)染前24 h，以1×105個(gè)/孔接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HCT116細(xì)胞于6孔板，細(xì)胞80%～90%匯合時(shí)，將已制備好的siRNA-Lip2000混合物加入6孔板，空白對(duì)照組僅加入脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000說(shuō)明，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞5～6 h，更換培養(yǎng)基(含血清及抗生素)后繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè)

HCT116細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將CST1的特異性siRNA及陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并設(shè)置空白對(duì)照組，收集轉(zhuǎn)染48 h的3組細(xì)胞，加入MTT溶液(5 mg/mL)，每孔20 μL，于37 ℃條件下孵育4 h，吸棄孔內(nèi)溶液，加入150 μL的DMSO溶液于每孔中，震搖混勻15 min，490 nm波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔的吸光度值(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)前在Transwell小室中間的聚碳酸酯濾膜上鋪上已預(yù)先稀釋好的Matrigel膠。將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HCT116細(xì)胞參照1.3分組制備成不含血清的單細(xì)胞懸液100 μL(約1×105個(gè)細(xì)胞)，接種于Transwell小室的上室，Transwell小室下室的每孔中加入含血清的培養(yǎng)基500 μL，于37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%的結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌后將小室轉(zhuǎn)移至24孔板，隨機(jī)選擇6～8個(gè)視野，倒置顯微鏡觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白上樣，依次經(jīng)10%SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入均按照1∶500稀釋的STAT3、p-STAT3、PCNA、MMP-2、MMP-9及內(nèi)參GAPDH抗體，洗膜，加HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯色，顯影，定影，應(yīng)用gel pro 4.0軟件分析各蛋白條帶灰度值，目的蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值為各蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 5種細(xì)胞中CST1蛋白的表達(dá)

正常結(jié)腸NCM460細(xì)胞和人結(jié)直腸癌SW480、HCT116、Caco2和HT29細(xì)胞中CST1蛋白的表達(dá)分別為0.068±0.009、0.254±0.028、0.478±0.050、0.268±0.030、0.339±0.035。4種人結(jié)直腸癌細(xì)胞中CST1蛋白的表達(dá)均顯著高于正常結(jié)腸NCM460細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 5種細(xì)胞中CST1蛋白表達(dá)的比較

2.2 CST1 siRNA轉(zhuǎn)染的效果

空白對(duì)照組、NC組和si-CST1組HCT116細(xì)胞中CST1蛋白的表達(dá)分別為0.526±0.054、0.515±0.051、0.096±0.012。si-CST1組HCT116細(xì)胞的CST1蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，而NC組HCT116細(xì)胞的CST1蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 3組HCT116細(xì)胞中CST1蛋白表達(dá)的比較

2.3 CST1 siRNA對(duì)HCT116細(xì)胞活力和侵襲能力的影響

各組細(xì)胞活力和侵襲能力檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較，si-CST1組細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞侵襲能力顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1、圖3。

表1 3組HCT116細(xì)胞的活力和侵襲能力比較()

注：與NC組比較，aP<0.05

圖3 3組HCT116細(xì)胞的侵襲能力比較 A 空白對(duì)照組 B NC組 C si-CST1組

2.4 CST1 siRNA對(duì)3組HCT116細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路的影響

Western blotting檢測(cè)STAT3、p-STAT3及STAT3信號(hào)通路下游與增殖、侵襲相關(guān)的PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與NC組相比，si-CST1組HCT116細(xì)胞中p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)均顯著降低(P均<0.05)。3組HCT116細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖4。

表2 3組HCT116細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的比較

注：與NC組比較，aP<0.05

圖43組HCT116細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的比較

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與基因表達(dá)異常、突變等有密切關(guān)系，目前已明確了腫瘤發(fā)生的部分機(jī)制，但惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及向周圍浸潤(rùn)仍是腫瘤治療的一個(gè)難題。有研究表明，CST1基因異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。CST1表達(dá)對(duì)胰腺癌增殖起促進(jìn)作用，可作為胰腺癌早期檢測(cè)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[7]；CST1的高表達(dá)與乳腺癌患者生存期呈負(fù)相關(guān)，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成能力及轉(zhuǎn)移[8]。CST1對(duì)結(jié)直腸癌的影響尚未明確，因此本研究首先檢測(cè)了不同結(jié)直腸癌細(xì)胞中的CST1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中CST1表達(dá)均明顯高于正常結(jié)腸細(xì)胞，結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中CST1表達(dá)最高，故選擇其作為研究對(duì)象。RNA干擾(RNAi)技術(shù)是一種能在轉(zhuǎn)錄后阻斷特異性基因表達(dá)的新技術(shù)，具有高效性和特異性，與其他基因表達(dá)阻斷技術(shù)相比更具優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療、基因功能研究等方面[9-10]。本研究將設(shè)計(jì)合成的CST1的特異性siRNA轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CST1表達(dá)受到抑制后結(jié)腸癌細(xì)胞的活力及侵襲能力均明顯降低，提示CST1表達(dá)受抑可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

STAT3是STAT家族成員，其與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成、分化等密切相關(guān)。研究表明，在結(jié)直腸癌、肺癌等多種人類腫瘤中均存在STAT3信號(hào)的異?；罨?，其活化可加速腫瘤進(jìn)展，因此被稱為癌基因[11-12]。另有研究顯示，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的STAT3信號(hào)可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[13]。STAT3并不直接引起腫瘤發(fā)生，而是通過(guò)調(diào)節(jié)某些與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的因子的表達(dá)從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。PCNA是一種僅出現(xiàn)在增殖狀態(tài)細(xì)胞核內(nèi)的酸性蛋白質(zhì)，是合成DNA不可或缺的因子，在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)升高，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)[14]。高侵襲和遷移能力是惡性腫瘤細(xì)胞的主要特征，而細(xì)胞外基質(zhì)是抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的主要屏障。MMP-2和MMP-9是MMP家族的主要蛋白水解酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，其異常表達(dá)可破壞細(xì)胞外基質(zhì)平衡，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。研究表明，結(jié)直腸癌、肺癌等多種腫瘤中均可檢測(cè)到MMP-2和MMP-9表達(dá)水平升高，而抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)可減弱結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲遷移能力[16-17]。本研究結(jié)果顯示，CST1基因表達(dá)受抑可降低p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，提示CST1基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響與下調(diào)STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，RNA干擾 CST1基因表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其機(jī)制可能與下調(diào)STAT3信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果提示CST1可能是結(jié)直腸癌診療的一個(gè)有效靶點(diǎn)，但這需要更多的研究證實(shí)。