肝纖維化是由各種急慢性肝損傷所引起的，由細胞外基質(zhì)(ECM)包括膠原蛋白、透明質(zhì)酸在肝組織間質(zhì)的合成和降解不平衡而導致的病理改變[1]。氧化應激是影響肝纖維化進展的重要因素，其可促進肝纖維化形成，加重肝細胞壞死和凋亡[2]。氧化應激是許多肝臟疾病的發(fā)病機制，在肝臟疾病的發(fā)展中起著重要作用[3]。近年來的研究表明，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)通過產(chǎn)生活性氧簇(ROS)等過氧化物來介導氧化應激參與肝纖維化的進程，與肝纖維化密切相關(guān)，而NOX家族成員之一的NOX4是ROS的主要來源，其在引起肝纖維化的主要細胞肝星狀細胞(HSC)中表達豐富，并通過介導多條細胞信號通路來誘導HSC活化，從而導致肝纖維化[4]。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是細胞抵御氧化應激的重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和下游基因表達，在四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化中起保護作用[5]。本實驗采用CCl4誘導建立大鼠肝纖維化模型，觀察肝纖維化形成過程中肝組織中Nrf2 mRNA、NOX4 mRNA及血清ROS水平的變化，探討三者在肝纖維化形成過程中的作用，為臨床延緩和預防肝纖維化發(fā)生、發(fā)展提供新的診療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要試劑

選取清潔健康的雄性大鼠30只，體重為190～210 g，購自河北醫(yī)科大學生理實驗室。血清ROS比色法試劑盒購自江蘇南京建成公司。Trizol裂解液、異丙醇、隨機引物、Buffer、dNTP、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、Nrf2、β-actin引物購自上海生工生物科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備及分組 將30只雄性SD大鼠隨機分為兩組，正常對照組6只，模型組24只。模型組大鼠每周2次給予40% CCl4油劑皮下注射，共8周，首次劑量為5 mL/kg，其后3 mL/kg。正常對照組給予相同劑量的食用油劑皮下注射。兩組大鼠均給予正常飲食。在第8周殺死正常對照組大鼠6只，在2、4、6、8周分別殺死模型組大鼠6只，留取相同部位的肝組織及血清備用。

1.2.2 組織病理學檢查 10%甲醛溶液浸泡固定肝左葉組織，乙醇梯度脫水，二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ透明，浸蠟包埋，切成3 μm切片，常規(guī)HE及 Masson三色染色，光學顯微鏡下觀察。根據(jù)膠原纖維增殖和肝臟結(jié)構(gòu)破壞程度，將肝纖維化分為S0～S4期：(1)S0期 無纖維化；(2)S1期 纖維化擴大但僅局限于小葉中央，未形成小葉間隔；(3)S2期 纖維化擴大，形成多條纖維間隔，但小葉結(jié)構(gòu)大致保留；S3期 大量纖維間隔形成并破壞肝小葉，導致小葉結(jié)構(gòu)紊亂，但無肝硬化；(4)S4期 早期肝硬化形成。

1.2.3 血清ROS水平測定 采用比色法測定血清ROS水平。

1.2.4 Real-time PCR測定肝組織中Nrf2、NOX4 mRNA水平 (1)采用TRizol試劑一步法抽提肝組織中總RNA，采用紫外線分光光度計測量RNA水平和純度；(2)取1 μg總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；(3)按照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10反應體系進行Real-time PCR過程。PCR反應條件：94 ℃預變性10 min，隨后依次在94 ℃環(huán)境下15 s，60 ℃環(huán)境下60 s，共45個循環(huán)，反應結(jié)束。熒光定量PCR讀取每個目的基因與對照基因β-actin的CT值，并用Quantity One軟件進行相對定量統(tǒng)計分析，以2-ΔΔCT表示mRNA的相對表達量。Real-time PCR引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 病理學檢查結(jié)果

光鏡下，正常對照組可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞索排列整齊，肝細胞無病變。在模型組早期階段，肝細胞水腫，氣球樣變及部分脂肪變；隨著造模時間延長，細胞脂肪變更加明顯，匯管區(qū)炎性反應加重，并伴有不同程度的肝細胞壞死，肝小葉中央靜脈周圍及匯管區(qū)纖維沉積明顯增多；第8周時，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，形成假小葉。2周時模型組與正常對照組肝臟膠原纖維面積百分比的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而隨著造模時間的延長，與正常對照組相比，模型組的肝纖維化程度逐漸加重，肝臟膠原纖維面積百分比在4、6、8周時升高(6、8周時升高更明顯)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組的肝纖維化病理分期和膠原纖維面積百分比比較()

注：模型組(2周)與正常對照組比較，aP>0.05；模型組(4、6、8周)與正常對照組比較，bP<0.05

2.2 兩組肝組織中Nrf2、NOX4 mRNA水平變化

2、4、6、8周時模型組肝組織中Nrf2 mRNA、NOX4 mRNA水平均較正常對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但隨著肝纖維化的形成及加重，Nrf2 mRNA水平的升高幅度較NOX4 mRNA低，6、8周時尤為明顯。見表3、圖1。

表3 兩組肝組織中Nrf2、NOX4mRNA水平比較()

注：各時期模型組與正常對照組相比，aP<0.05

2.3 兩組血清ROS水平變化

隨著造模時間的延長，模型組肝纖維化逐漸形成和發(fā)展，血清ROS水平整體呈升高趨勢，6周時達到最高，8周時有所下降，且模型組2、4、6、8周時血清ROS水平均較正常對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

圖1 兩組肝組織中Nrf2、NOX4 mRNA水平變化

表4肝纖維化形成過程中血清ROS的變化

組別數(shù)量/只ROS/μg·mL-1正常對照組61.56±0.84模型組2周61.84±0.69a模型組4周61.72±0.65a模型組6周62.48±1.14a模型組8周61.82±0.46a

注：各時期模型組與正常對照組相比，aP<0.05

2.4 相關(guān)性分析

將Nrf2、NOX4與ROS進行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示Nrf2與ROS、Nrf2與NOX4、NOX4與ROS三組之間均存在正相關(guān)性(r=0.862，P=0.000；r=0.091，P=0.001；r=0.315；P=0.000)。

3 討論

肝纖維化是ECM過度沉積引起的慢性肝臟病理改變，是肝硬化和肝細胞癌發(fā)生的必經(jīng)途徑，其發(fā)生涉及各種機制，如局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活、基質(zhì)金屬蛋白酶表達失衡和自噬等。近年來的研究表明，NOX活化誘導的ROS介導的氧化應激與肝纖維化形成密切相關(guān)。NOX家族主要由NOX1、NOX2、NOX3、NOX4等多種亞基組成，其中NOX4是纖維化發(fā)生過程中ROS的主要來源[6]。NOX4通過產(chǎn)生ROS，分別介導了血小板生成素、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等促纖維化因子作用下的細胞活化[7]。TGF-β是肝纖維化形成的重要調(diào)節(jié)因子，可通過TGF-β/Smad-3信號轉(zhuǎn)導通路誘導NOX4，介導HSC的活化，刺激膠原蛋白的合成和沉積。研究表明，NOX4的促纖維化反應是由TGF-β介導的，它在TGF-β誘導的纖維化反應中具有促進膠原產(chǎn)生等重要作用[8]。以往研究表明TGF-β激活HSC的過程依賴NOX的激活及ROS的產(chǎn)生，產(chǎn)生的ROS刺激PI3K/Akt途徑是肝纖維化形成的關(guān)鍵。此外，使用NOX4抑制劑GKT137831可有效減少CCl4或膽管結(jié)扎誘導的大鼠ROS的產(chǎn)生和肝纖維化[9-10]。上述結(jié)果都說明NOX4激活產(chǎn)生ROS介導的氧化應激與肝纖維化的形成密切相關(guān)。本實驗以CCl4誘導建立大鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的形成，肝組織中NOX4 mRNA及血清ROS水平呈升高趨勢，但8周時模型組血清ROS水平有所下降，這可能是由于隨著肝損傷的加重，機體無法清除大量的ROS，導致其明顯升高，而在肝纖維化后期，眾多促肝纖維化激活因子活化，使ROS的促纖維化作用弱化，表達水平下降。該結(jié)果表明ROS在肝纖維化形成中起著重要作用。研究表明阻斷PI3K活化可抑制HSC增殖和膠原蛋白沉積，從而抑制肝纖維化形成[8]，這與本次實驗結(jié)果相符，也證實了ROS的促纖維化作用。進一步行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NOX4 mRNA與ROS水平呈正相關(guān)。這一結(jié)論不僅證實了NOX4的促纖維化作用，而且其促纖維化作用可能是通過產(chǎn)生ROS來介導氧化應激實現(xiàn)的。以往研究顯示氧化應激可促進HSC激活以及增加膠原合成。

Nrf2作為體內(nèi)抗氧化反應的重要轉(zhuǎn)錄因子，其與肝臟疾病的關(guān)系也日益受到重視[11-12]。生理狀態(tài)下Nrf2與其細胞質(zhì)錨連分子Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(KEAP1)結(jié)合而被泛素依賴性蛋白酶系統(tǒng)降解，僅殘留少部分用于維持還原型谷胱甘肽(GSH)等的基礎(chǔ)表達。氧化應激時KEAP1發(fā)生磷酸化變構(gòu)，與Nrf2解離。自由態(tài)的Nrf2進入細胞核，與抗氧化反應元件(ARE)結(jié)合，Nrf2/ARE通路被激活后，啟動下游的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶，清除氧化應激過程中過多的ROS，增強機體的抗氧化能力[13]。TGF-β是肝纖維化形成的關(guān)鍵因子，可通過Smad-3的激活而下調(diào)GST、GCLC、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的表達，而Nrf2能通過調(diào)節(jié)氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄激活蛋白和核因子-κB (NF-κB)，下調(diào)TGF-β。GST、GCLC、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶均為Nrf2的下游基因，由此可見Nrf2與肝纖維的形成密切相關(guān)。因此，本研究以CCl4誘導建立大鼠肝纖維化模型，觀察肝纖維化形成過程中Nrf2的表達，發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的進展，大鼠肝組織中Nrf2的表達呈升高趨勢，將Nrf2與NOX4的變化結(jié)合起來觀察，發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的進展，兩者的表達均呈升高趨勢，并且相關(guān)性分析顯示兩者的表達呈正相關(guān)，但Nrf2的表達升高幅度較NOX4低，在6、8周時尤為明顯，說明隨著肝纖維化的形成和發(fā)展，Nrf2無法拮抗NOX4，從而使其促進了肝纖維化的形成和發(fā)展，此結(jié)論不僅證實了NOX4的促纖維化效應以及Nrf2的抗纖維化作用，也說明了NOX4、Nrf2在肝纖維化形成階段可能發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)給予Nrf2激活劑，可減慢由膽道結(jié)扎引起的小鼠肝纖維化的進展及降低促纖維化基因的表達。此外，與正常小鼠相比，Nrf2缺陷鼠對CCl4誘導的肝損傷修復顯著延遲，肝纖維化程度及炎性反應明顯加重，這是由于肝細胞的Nrf2及其編碼的酶減少，對CCl4及其代謝產(chǎn)物的解毒作用減弱有關(guān)[14]。這與本實驗結(jié)果相符，也證實了Nrf2的抗纖維化效應。

本研究通過觀察Nrf2、NOX4的表達與血清ROS水平的動態(tài)變化，證實了NOX4、ROS的促纖維化作用，以及Nrf2的抗纖維化作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)Nrf2、NOX4、ROS呈正相關(guān)，說明可能存在NOX4通過產(chǎn)生ROS介導的促纖維化因子影響Nrf2表達。由此可見，Nrf2可能成為肝纖維化治療的一個新靶點。