血管內(nèi)皮細胞活化是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)患者早期重要的病理生理改變[1-2]，活化的血管內(nèi)皮細胞釋放多種炎性因子、血管活性物質(zhì)以及大量的氧自由基，促進冠心病的發(fā)生發(fā)展[3]。CD40/CD40配體(CD40L)分布于內(nèi)皮細胞和血小板，可通過多種信號通路活化血管內(nèi)皮細胞，使其過表達黏附分子、炎性因子以及氧自由基等，與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)[4]。白細胞介素(IL)-35是由調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)等分泌的新型抗炎因子，可以抑制脂多糖(LPS)對血管內(nèi)皮細胞的活化，從而抑制血管內(nèi)皮細胞炎性因子的表達，減輕炎性反應[5]，但尚不明確IL-35是否可抑制sCD40L對血管內(nèi)皮細胞的活化。本研究檢測冠心病患者外周血清中可溶性CD40配體(sCD40L)和IL-35的水平，并分析IL-35對sCD40L活化血管內(nèi)皮細胞的抑制作用，探討IL-35在冠心病發(fā)病中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2018年2月至2018年8月在江蘇省濱?？h人民醫(yī)院心內(nèi)科診斷的冠心病患者43例，其中不穩(wěn)定型心絞痛患者20例(UA組)，急性ST段抬高型心肌梗死患者23例(STEMI組)，所有患者行冠狀動脈造影檢查，診斷和分型均符合《心臟病學》診斷標準[6]；同時選取年齡、性別匹配的20例健康體檢者作為對照組。排除標準：合并感染性疾病、瓣膜性心臟病、擴張型心肌病、腦卒中、嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤以及使用類固醇類藥物的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(批準號01/2018)，所有參加者簽署知情同意書。

1.2 試劑

細胞因子IL-35購自美國Bio-rad公司；sCD40L購自武漢艾美捷科技有限公司；sCD40L、IL-35、E-選擇素、可溶性細胞間黏附因子(sICAM-1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、氧自由基(ROS)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 血液標本采集

AMI患者在入院時采集外周靜脈血3 mL，其余患者在入院次日清晨空腹采集靜脈血3 mL，置于肝素鈉抗凝管，3 000 r/min離心2 min，收集血清，儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)的培養(yǎng)

取剖宮產(chǎn)孕婦分娩的健康新生兒臍帶20 cm，采用胰酶消化法獲得血管內(nèi)皮細胞，將其接種于含20%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，待細胞長至80%融合狀態(tài)后，選取第2～5代細胞用于實驗。流式細胞儀檢測內(nèi)皮細胞表面標記CD31，純度達85%以上。實驗分為空白組、sCD40L組和IL-35+sCD40L組。sCD40L組加入25 μg/mLs CD40L，IL-35+sCD40L組加入20 ng/mL IL-35和25 μg/mL sCD40L，培養(yǎng)24 h后收集細胞，PBS洗滌2次，上清液儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ELISA法檢測外周血清中IL-35、sCD40L水平及細胞培養(yǎng)上清液中E-選擇素、sICAM-1水平

使用ELISA試劑盒檢測外周血清中IL-35、sCD40L水平及細胞培養(yǎng)上清中E-選擇素、sICAM-1的水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 比色法檢測HUVEC中MDA水平及SOD活性

取對數(shù)生長期的HUVEC以1×105/mL的細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)方法及分組同1.4，培養(yǎng)后棄上清，按照試劑盒說明書檢測HUVEC的MDA水平及SOD活性。

1.7 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針法檢測HUVEC中ROS活性

將血管內(nèi)皮細胞接種于6孔板，初始密度為4×105/孔，培養(yǎng)方法及分組同1.4，每孔加入2 mL無血清培養(yǎng)液以及20 μmol/L DCFH-DA溶液，混勻，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育30 min后用培養(yǎng)液輕輕洗滌細胞2次，熒光顯微鏡觀察拍照(激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm)，ImageJ軟件計算平均熒光強度值(IOD)。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用student′st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；偏態(tài)分布采用中位數(shù)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗或Kruskal-Wallis檢驗；線性相關(guān)分析采用Spearman分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者外周血清IL-35和sCD40L水平比較

3組患者年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、吸煙史均無統(tǒng)計學差異，見表1。ELISA試劑盒檢測外周血清IL-35及sCD40L的水平。與對照組相比，UA組、AMI組IL-35水平均降低，且STEMI組降低更為顯著；而sCD40L水平顯著升高，且STEMI組升高更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，結(jié)果見表2。

表1 3組患者臨床資料比較

表2 3組患者外周血清IL-35和sCD40L水平比較

注：與對照組比較，(1)P<0.05；與UA組比較，(2)P<0.05

2.2 冠心病患者外周血清IL-35與sCD40L的相關(guān)性分析

冠心病患者外周血清IL-35水平與sCD40L水平呈負相關(guān)(r=-0.443，P<0.01)，見圖1。

2.3 IL-35對HUVEC分泌E-選擇素、sICAM-1的干預作用

ELISA法檢測3組HUVEC培養(yǎng)上清中E-選擇素、sICAM-1的水平。與空白組相比，sCD40L組E-選擇素、sICAM-1水平均顯著增加(P均<0.05)；與sCD40L組相比，IL-35+sCD40L組E-選擇素、sICAM-1水平均顯著降低(P均<0.05)，見表3。

表3 3組HUVEC培養(yǎng)上清中E-選擇素、sICAM-1水平比較

注：與空白組比較，(1)P<0.05；與sCD40L組比較，(2)P<0.05

2.4 IL-35對HUVEC中MDA水平及SOD活性的影響

比色法檢測3組HUVEC中MDA水平及SOD活性。與空白組相比，sCD40L組HUVEC中MDA水平顯著升高，SOD活性顯著下降(P均<0.05)；與sCD40L組相比，IL-35+sCD40L組HUVEC中MDA水平顯著下降，SOD活性顯著升高(P均<0.05)，見表4。

表4 3組HUVEC中MDA水平及SOD活性比較

注：與空白組比較，(1)P<0.05；與sCD40L組比較，(2)P<0.05

2.5 IL-35對HUVEC中ROS活性的影響

DCFH-DA熒光探針法檢測3組HUVEC中ROS活性。與空白組相比，sCD40L組HUVEC中ROS活性顯著升高(13.45±4.12對3.65±2.08，P<0.05)；與sCD40L組相比，IL-35+sCD40L組HUVEC中 ROS活性顯著降低(7.09±3.06對3.65±2.08，P<0.05)，見圖2。

注：A為空白組；B為sCD40L組；C為IL-35+sCD40L組

3 討論

血管內(nèi)皮細胞活化在冠心病的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[7]，血管內(nèi)皮細胞具有阻止巨噬細胞浸潤和泡沫細胞形成、調(diào)節(jié)凝血和阻止血栓形成的功能。活化的血管內(nèi)皮細胞可分泌多種生物活性物質(zhì)如E-選擇素、細胞間黏附分子和ROS等，導致動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生[3]，慢性炎性反應是導致血管內(nèi)皮細胞活化的主要因素，并貫穿于整個冠心病的發(fā)生發(fā)展過程。炎性反應的激活以及促炎/抗炎因子的失衡與動脈粥樣硬化的發(fā)生、斑塊的破裂、血栓的形成等密切相關(guān)，促進了穩(wěn)定型心絞痛向UA，加劇了疾病進展[8]。

CD40/CD40L的相互作用可以調(diào)節(jié)氧化應激，影響免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等信號通路，與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)[9]。CD40L與CD40相互作用促進單核細胞、巨噬細胞等黏附于血管內(nèi)皮細胞，誘導細胞間黏附分子(ICAM-1)、E-選擇素等的表達，增加氧自由基的生成，導致氧化應激[10]；同時，CD40通過與CD40L的相互作用調(diào)控多種基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，促進動脈粥樣斑塊的破裂[11]。sCD40L是CD40L水解形成的具有生物活性的可溶性片段，與CD40L具有相同的生物學功能[12]。Yuan等[4]研究表明，循環(huán)血液中sCD40L能刺激泡沫細胞的形成，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展，增加粥樣斑塊的不穩(wěn)定性，加速冠心病的發(fā)展。Heeschen等[13]研究表明，sCD40L對冠心病具有一定的預測價值。Fouad等[14]研究發(fā)現(xiàn)，UA及急性心肌梗死患者外周血清sCD40L水平顯著高于穩(wěn)定型心絞痛及健康體檢者。本研究結(jié)果與上述研究一致，顯示STEMI患者與UA患者外周血清sCD40L水平顯著升高，且STEMI患者升高更顯著。

IL-35是IL-12家族的新成員，由兩個亞基組成，其主要生物學功能是：(1)抑制血管炎性反應；(2)促進Treg細胞活化，增強其抑制功能；(3)抑制輔助T細胞(Th)1、Th17等細胞的增殖；(4)促進抗炎因子如IL-10的產(chǎn)生，抑制促炎因子如IL-17的產(chǎn)生[15]。本研究表明，冠心病患者外周血IL-35水平顯著降低，且STEMI患者降低更為顯著，這與Lin等[16]研究結(jié)果一致。Mor 等[17]研究表明，冠心病患者外周血Treg比例下降，其抑制功能也明顯下調(diào)。IL-35可能通過加重炎性反應參與冠心病的發(fā)生。

本研究顯示IL-35與sCD40L水平呈負相關(guān)，IL-35能顯著抑制sCD40L誘導的內(nèi)皮細胞E-選擇素、sICAM-1的分泌。E-選擇素和ICAM-1是血管內(nèi)皮細胞活化的標志，血管內(nèi)皮細胞活化后分泌大量的E-選擇素和ICAM-1，兩者通過與細胞間受體結(jié)合，促進白細胞、單核細胞、T細胞緊密黏附于血管內(nèi)皮細胞，加重血管內(nèi)皮細胞的功能障礙，影響動脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性[18]，促進冠心病的發(fā)生發(fā)展。

MDA和SOD可反映機體脂質(zhì)過氧化、受自由基攻擊的損傷程度和機體清除氧自由基的能力。在生理狀態(tài)下，氧自由基生成和清除維持平衡狀態(tài)；在病理狀態(tài)下，這一平衡被打破，細胞受損或活化，產(chǎn)生過量的氧自由基，使機體處于氧化應激狀態(tài)。本研究顯示，IL-35明顯降低血管內(nèi)皮細胞脂質(zhì)過氧化物水平，上調(diào)內(nèi)皮細胞清除氧自由基的能力，從而抑制sCD40L對血管內(nèi)皮細胞的活化。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者外周血IL-35水平顯著降低，而sCD40L水平顯著升高，兩者呈負相關(guān)。IL-35能抑制sCD40L誘導的血管內(nèi)皮細胞的活化，其機制主要通過降低血管內(nèi)皮細胞脂質(zhì)氧化及血管內(nèi)皮細胞氧自由基的水平，上調(diào)血管內(nèi)皮細胞清除氧自由基的能力。結(jié)果表明，IL-35和sCD40L在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，調(diào)控IL-35和sCD40L可能是治療冠心病的新途徑。