王 亮，謝宇，羅 君，薛鑫宇，唐靖雯，張麗艷*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州貴陽 550025；2.貴州廣濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，貴州貴陽 550014；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州貴陽 550001；4.貴州威門藥業(yè)股份有限公司，貴州貴陽 550004)

補(bǔ)骨膠囊中中藥骨碎補(bǔ)、杜仲、鹿骨粉已被國家衛(wèi)生健康委員會(huì)列為保健食品、中藥，將其與現(xiàn)代常用于增加骨密度的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑骨膠原蛋白粉、碳酸鈣、維生素D3相結(jié)合，制成以增加骨密度、防止骨質(zhì)疏松為主要功效的保健食品。方中骨碎補(bǔ)作為傷科的要藥，常用于治療骨傷，具有療傷止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效，治療、預(yù)防骨傷療效顯著[1]?，F(xiàn)代相關(guān)研究表明[2-4]，骨碎補(bǔ)中總黃酮具有抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨傷愈合的功效，其歷史悠久、資源豐富，具有良好的商用價(jià)值。為保證本品質(zhì)量，本處方以骨碎補(bǔ)中柚皮苷為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，參考2015版《中國藥典》一部“骨碎補(bǔ)”中柚皮苷的含量測(cè)定方法[1]，采用HPLC法建立補(bǔ)骨膠囊中柚皮苷的含量測(cè)定方法，可有效控制補(bǔ)骨膠囊質(zhì)量。

1 儀器與試藥

98-I-B電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；ABZ04-S型電子天平(上海梅特勒有限公司)；Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；柚皮苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110722-200309)；甲醇(色譜純，TEDIA)；補(bǔ)骨膠囊(自制)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法

參考2015版《中國藥典》一部項(xiàng)下“骨碎補(bǔ)”中柚皮苷的含量測(cè)定方法，采用高效液相色譜法測(cè)定本品柚皮苷含量。

2.2 色譜條件考察[5-6]

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取柚皮苷對(duì)照品20.08 mg，置干燥的25 mL容量瓶?jī)?nèi)，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。(柚皮苷含量以93.4%計(jì)，C=750.19 μg/mL)

2.2.2 流動(dòng)相考察 取柚皮苷對(duì)照品溶液，采用甲醇、乙腈、甲醇-水、甲醇-醋酸-水、甲醇-磷酸-水、甲醇-甲酸-水為流動(dòng)性對(duì)柚皮苷對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，甲醇和乙腈對(duì)比，甲醇較乙腈峰形好。柚皮苷以醋酸、水為流動(dòng)相時(shí)，出峰時(shí)間適中。以磷酸和甲酸為流動(dòng)相時(shí)，出峰時(shí)間延后。采用甲醇-水時(shí)，峰形無變化。選擇甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)時(shí)色譜峰對(duì)稱性(0.87～1.1)較好，保留時(shí)間(10～12)適中。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 取柚皮苷對(duì)照品溶液，用HPLC-DAD檢測(cè)，波長(zhǎng)在200～400 nm之間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示在283 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰且靈敏度高，故確定柚皮苷最大吸收波長(zhǎng)為283 nm。

2.2.4 柱溫考察 取柚皮苷對(duì)照品溶液，分別考察25 ℃、30 ℃、35 ℃下柱溫對(duì)柚皮苷的保留時(shí)間的影響，結(jié)果表明柚皮苷的保留時(shí)間隨著柱溫的升高而縮短，在30 ℃時(shí)保留時(shí)間在10～12 min，保留時(shí)間適中。

2.2.5 色譜條件 色譜柱Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)；流速：1.0 mL·min-1；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。色譜見圖1。

A.柚皮苷對(duì)照品；B.補(bǔ)骨膠囊供試品；C.陰性樣品

2.3 供試品溶液制備考察[7]

2.3.1 提取溶劑考察 取補(bǔ)骨膠囊內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取0.5 g，共4份，置150 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入水、乙醇、甲醇、50%甲醇5 0mL，密塞，精密稱定，加熱回流30 min，取出，放冷，分別用甲醇、水、乙醇、50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果甲醇作為提取溶劑時(shí)色譜峰出現(xiàn)前沿峰，對(duì)稱性不好，水、乙醇提取物的峰面積較甲醇峰面積小，提取不完全，采用50%甲醇制備補(bǔ)骨膠囊樣品時(shí)，前沿峰消失，對(duì)稱性好，故選用50%的甲醇作為提取溶劑。

2.3.2 提取方法考察[8]取補(bǔ)骨膠囊內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取0.5 g，共12份(以各重復(fù)性的RSD結(jié)果為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn))，置150 mL具塞錐形瓶中，分別精密加50%甲醇50 mL，密塞，精密稱定，分別超聲和加熱回流0.5 h，取出，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果超聲樣品的重復(fù)性的RSD為6.96%，加熱回流樣品的重復(fù)性的RSD為0.27%，故選用加熱回流提取樣品。

2.3.3 提取時(shí)間考察 取補(bǔ)骨膠囊內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取0.5 g，共6份，置150 mL具塞錐形瓶中，分別精密50%甲醇5 0mL，密塞，精密稱定，分別加熱回流30 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，取出，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h的柚皮苷含量無明顯變化，故選取0.5 h提取樣品。

2.3.4 溶劑提取率考察 取補(bǔ)骨膠囊內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取0.25 g，置250 mL具塞錐形瓶中，分別精密加50%甲醇100 mL，密塞，精密稱定，加熱回流30 min，取出，放冷，搖勻，過濾，棄去濾液。濾紙和殘?jiān)?0 mL具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇20 mL，密塞，精密稱定，加熱回流30 min，取出，放冷，搖勻，過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果用50%甲醇加熱回流30 min提取完全，未檢出柚皮苷成分峰。

2.3.5 供試品溶液制備 按照以上優(yōu)選的方法進(jìn)行補(bǔ)骨膠囊樣品提取，即取補(bǔ)骨膠囊內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取0.25 g，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇100 mL，密塞，精密稱定，加熱回流30 min，取出，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得補(bǔ)骨膠囊柚皮苷供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液制備

按處方取杜仲藥材2 g，加10倍量水，加熱回流提取2次，每次2 h。過濾，合并濾液，置干燥的50 mL容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得補(bǔ)骨膠囊缺骨碎補(bǔ)陰性樣品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

取1 mL濃度為750.19 μg/mL的對(duì)照品母液至10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液，濃度為75.019 μg/mL。再取5個(gè)10 mL容量瓶倍半稀釋依次得到濃度為37.510 μg/mL、18.755 μg/mL、9.378 μg/mL、4.689 μg/mL、2.345 μg/mL。分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：Y=17.85X+5.500 9(R2=0.999 9)。結(jié)果表明，柚皮苷在2.345～75.019 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取補(bǔ)骨膠囊內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取0.25 g，按“2.3.5”項(xiàng)下供試品溶液方法制備供試品溶液，精密吸取9.378 μg/mL對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，柚皮苷峰面積RSD為0.43%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取補(bǔ)骨膠囊內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取0.25g，按“2.3.5”項(xiàng)下供試品溶液方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h，精密吸取56.768 μg/mL對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果補(bǔ)骨膠囊中柚皮苷的峰面積RSD為1.01%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取補(bǔ)骨膠囊內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取0.25 g，共6份，按“2.3.5”項(xiàng)下供試品溶液方法制備供試品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果補(bǔ)骨膠囊中柚皮苷的平均含量為4.16 mg/g，RSD為1.25%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品6份，每份約0.125 g，精密稱定，分別精確加入柚皮苷對(duì)照品溶液(0.005 2 mg/mL)100 mL，按“2.3.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，按照外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品含量及加樣回收率。結(jié)果表明，加樣回收率為96.21%，在回收率限度90%～108%之間，RSD在3%以內(nèi)，該含量測(cè)定方法回收率高，符合測(cè)定要求。結(jié)果見表1。

表1 柚皮苷加樣回收率試驗(yàn)

2.10 樣品含量測(cè)定

分別取3批不同批號(hào)的補(bǔ)骨膠囊內(nèi)容物研細(xì)，各精密稱取0.25 g，按“2.3.5”項(xiàng)下供試品溶液方法制備供試品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算補(bǔ)骨膠囊樣品含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定 (n=3，%)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC建立補(bǔ)骨膠囊中柚皮苷含量測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、重復(fù)性好、靈敏度高、分離度良好、測(cè)定方法穩(wěn)定可行，可有效控制補(bǔ)骨膠囊的質(zhì)量。