冉亞東，原歡歡，禹奇男，彭世陸，蔣燕霞，劉世琪，彭濤，秦少容，董自亮

(太極集團有限公司，重慶 408000)

滋膵飲出自清·張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》，由黃芪、生地黃、山藥、山萸肉、生豬胰子組成，具有滋補膵臟、益脾固腎之功效，主治消渴。加味滋膵飲為卿玉玲主任醫(yī)師在大量臨床實踐的基礎上，去方中豬胰子，加莪術、益母草、丹參、大黃而成。組方具有養(yǎng)陰益氣、活血通絡的功能，用于治療氣陰兩虛、血瘀所致消渴，癥見腰膝酸軟、口渴喜飲、神疲氣短、小便量多渾濁、舌質暗淡、舌苔薄白、脈細無力、糖尿病腎病見上述癥狀者。本課題組將其開發(fā)成生物利用度高、順應性好、攜帶方便的現(xiàn)代制劑加味滋膵膠囊。

中藥指紋圖譜是評價含有多種組分中藥復方質量的有效手段，具有專屬性、整體性和模糊性等特點，其優(yōu)點在于盡可能全面地反映復方中的化學成分及其相對比例，保證中藥及其制劑的穩(wěn)定性和可靠性，已得到國內(nèi)外普遍認可[1-2]。本文參考相關文獻[3-4]，通過HPLC-DAD 法首次建立加味滋膵膠囊的指紋圖譜，以期控制該復方制劑的質量，為該復方制劑的開發(fā)提供參考。

1 儀器及試藥

Agilent 1100系列液相色譜儀(Agilent公司)，Agilent色譜工作站；BP211型分析天平；HDM調溫電熱套金壇市華峰儀器設備有限公司)；DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

黃芪、山茱萸、丹參、山藥等藥材均購自安徽亳州市場，經(jīng)太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司質檢中心楊修齊研究員鑒定符合藥典要求。

乙腈、甲酸為色譜純，水為超純水，其余均為分析純。馬錢苷對照品(批號111640-201507，質量分數(shù)99.2%)，購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.01%甲酸水；流速：1.0 mL/min；檢測波長：278 nm；柱溫：27 ℃；進樣量：20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 供試品溶液制備

精密稱取加味滋膵膠囊0.25 g，以40 mL水復溶，用95%乙醇調整醇含量至75%，均勻攪拌，靜置6 h，離心(20 min，3 000 r·min-1)，用75%乙醇洗滌沉淀2次，離心(20 min，3 000 r·min-1)，合并上清，減壓濃縮除去乙醇，將得到的提取物冷凍干燥，得到加味滋膵膠囊指紋圖譜樣品。

2.3 對照品溶液制備

分別精密稱取馬錢苷對照品適量，用甲醇溶解，配制成馬錢苷濃度為65 μg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 指紋圖譜專屬性檢測

精密稱定加味滋膵膠囊樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測樣品，記錄各樣品內(nèi)色譜峰、保留時間、峰面積。分別精密吸取空白溶劑、樣品溶液注入HPLC儀中，記錄色譜與各標示峰的光譜圖。實驗結果表明，在該條件下空白無干擾。詳見圖1、圖2。

圖1 空白溶劑指紋圖譜

圖2 樣品指紋圖譜及光譜識別

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 精密稱取同一批樣品(批號：170801)，按照“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖。以重現(xiàn)性與分離度均好的11號峰(馬錢苷峰)為參照峰(S)，考察膠囊指紋圖譜各個共有峰的相對保留時間以及相對峰面積RSD值，結果見表2、表3，由表可知，各共有峰相對保留時間RSD均小于0.92%，相對峰面積RSD均小于4.36%，精密度良好，表明儀器性能穩(wěn)定。

表2 指紋圖譜精密度相對保留時間結果

表3 指紋圖譜精密度相對峰面積結果

2.5.2 重復性試驗 精密稱取同一批樣品(批號：170801)，按照“2.2”項下取供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。以重現(xiàn)性、分離度均好的11號峰(馬錢苷峰)為參照峰(S)，考察膠囊指紋圖譜各個共有峰的相對保留時間以及相對峰面積RSD值，見表4、表5，由表可知，相對保留時間RSD均小于0.47%，相對峰面積RSD均小于8.11%，表明該方法重復性良好。

表4 指紋圖譜重復性試驗結果

表5 指紋圖譜重復性相對峰面積結果

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批樣品(批號：170801)，按照“2.1”項下色譜條件，在0、4、5、12、16、20、24 h分別進樣，以重現(xiàn)性、分離度均好的11號峰(馬錢苷峰)為參照峰(S)，考察膠囊指紋圖譜各個共有峰相對保留時間以及相對峰面積RSD，見表6、表7，結果顯示，相對保留時間RSD均小于0.82%，相對峰面積RSD均小于9.09%，可判斷樣品24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表6 指紋圖譜穩(wěn)定性相對保留時間結果

表7 指紋圖譜穩(wěn)定性相對峰面積結果

2.6 指紋圖譜共有模式的建立及相似度分析

精密吸取18批加味滋膵膠囊樣品，按照“2.2”項下制備供試品溶液，取20 μL注入色譜儀，并記錄120 min內(nèi)的色譜圖。

采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件，生成共有模式的對照指紋圖譜(圖3)，不同批次樣品共有色譜峰13個。18批樣品的相似度在0.951～0.998之間(S1～S18相似度值分別為0.977、0.994、0.994、0.995、0.992、0.998、0.997、0.990、0.955、0.994、0.951、0.991、0.988、0.997、0.997、0.994、0.997、0.998)，相似度高，符合指紋圖譜相關要求。

圖3 18批加味滋膵膠囊樣品指紋圖譜疊加

3 討論

本實驗考察了190～400 nm全波長掃描、全波長掃描提取278 nm、278 nm單波長、全波長掃描提取210 nm、全波長掃描提取207 nm等5種掃描方式，結果從譜峰的分離度上看，278 nm單波長效果較佳，且在該波長下譜峰信息最豐富。故選擇278 nm單波長掃描方式。

本實驗考察乙腈-0.01%甲酸水；甲醇-0.01%磷酸水；乙腈-0.01%磷酸水；乙腈-水；乙腈-0.1%磷酸水5種不同的流動相,實驗結果顯示，加入酸可以優(yōu)化峰形，但隨著酸濃度的增加，色譜峰的分離度并沒有實質性變化，乙腈-0.01%磷酸水和乙腈-0.01%甲酸水色譜圖無明顯差異，甲醇-0.01%磷酸水色譜峰較寬，且若想達到較好的分離效果，可能需要較長的分析時間。綜合上述分析，最終流動相選擇乙腈-0.01%甲酸水。

綜上所述，本試驗采用HPLC-DAD建立的加味滋膵膠囊指紋圖譜，共有峰的相對保留時間穩(wěn)定；方法學考察表明重復性、穩(wěn)定性好，精密度均符合要求；采用相似度軟件分析樣品，計算出的相似度較高。以上實驗結果表明本實驗建立的方法成熟，各樣品批間一致性較好，可用于加味滋膵膠囊的質量控制。