曹露萍，李曉屏*，田夢影，蔡嘉洛，成 雅，廖 富

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙 410007)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是一種容易被漏診、誤診的特殊類型哮喘?；颊叩呐R床表現(xiàn)主要為未見明顯的喘息、呼吸短促等癥狀或體征[1]。有研究表明，CVA的發(fā)病機制與哮喘有著極高的相似性，兩者均為多種炎性細胞和炎性介質(zhì)及細胞因子參與的慢性呼吸道炎癥性疾病，其在臨床上的表現(xiàn)為呼吸道的高反應性且氣流受限具有可逆性的特征[2]。近年來有研究表明[3，4]，T輔助細胞(Th)亞群中1型和2型輔助T細胞功能失調(diào)可能是誘發(fā)哮喘發(fā)病的重要因素，而γ干擾素(IFN-γ)、白介素 4(IL-4)又分別是 Th1和 Th2的細胞因子。本研究試圖通過檢測CVA大鼠模型血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中 IL-4及IFN-γ含量，來探索和衛(wèi)溫肺合劑對CVA大鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠50只，月齡8～10周，體質(zhì)量200～ 260 g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(湘)2013-0006。由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，給予普通飲食及飲水。

1.1.2 試劑與藥物 和衛(wèi)溫肺合劑主要由桂枝、芍藥、生姜、炙甘草、大棗、厚樸、杏仁、黨參、麥冬等藥物組成，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院治未病中心提供。其功效為調(diào)和營衛(wèi)，溫潤肺氣。

卵蛋白(美國Sigma公司產(chǎn)品)；10%氫氧化鋁佐劑(上海化學試劑有限公司)；IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒：聯(lián)科生物科技有限公司(批號：230430316)；IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒：聯(lián)科生物科技有限公司(批號 238030316)。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 除正常組10只大鼠注射生理鹽水外，將上述40只SD大鼠在實驗進行的第1天及第8天分別于大鼠腹部取不同部位注射新鮮配制的致敏液[5](4%卵蛋白40 μg+10%氫氧化鋁100 μg，加入雙蒸水1 mL中組成混合液)1 mL，從第15天起，將各準備造模的模型組大鼠每天早晨10點用1%OA溶液霧化吸入半小時，持續(xù)1周，以激發(fā)哮喘。當觀測到各模型組大鼠出現(xiàn)腹肌明顯收縮，呼吸加深、加快、打噴嚏、持續(xù)抓鼻孔等癥狀時，提示造模成功[6]。

1.2.2 實驗分組與給藥 造模成功后，將上述50只大鼠按隨機分配原則平均分成5組(正常組，模型組，和衛(wèi)溫肺高劑量組、中劑量組、劑量組)。和衛(wèi)溫肺合劑低、中、高劑量組灌胃給藥濃度分別為2.0、4.0、8.0 g/(kg·d)，正常組及模型組則每天用2 mL生理鹽水灌胃。各組按實驗劑量給藥，連續(xù)給藥14 d，第15天處死動物。

1.2.3 指標檢測 ①血清中IL-4、IFN-γ含量檢測：按酶聯(lián)免疫試驗試劑盒說明書，用干燥無菌管采集大鼠腹主動脈血4 mL，靜置1 h后，4 ℃，2 000 r/min離心10 min，-20 ℃以下保存；②BALF中IL-4、IFN-γ含量檢測：按酶聯(lián)免疫試驗試劑盒操作說明書操作，將各組大鼠用生理鹽水行左肺支氣管肺泡灌洗術，沖洗3次后，將收集的BALF共10 mL混合均勻，以1 500 r/min離心5 min，取上清液，-20 ℃保存。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清IL-4、IFN-γ含量比較

經(jīng)測定，與正常組比較，造模成功后的模型組大鼠血清中IL-4值含量明顯升高，而IFN-γ值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示CVA的發(fā)病與IL-4、IFN-γ含量具有密切關系；相較于模型組，經(jīng)和衛(wèi)溫肺合劑治療后的各組大鼠的IL-4含量明顯降低，IFN-γ值明顯升高(P<0．05)，提示各組對CVA的治療均起到了一定作用，其中高劑量組療效最顯著，高劑量組大鼠血清IL-4及IFN-γ含量與低、中劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此外，各治療組血清IL-4及IFN-γ的含量相較于正常組，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

組別IL-4IFN-γ正常對照組14.80±1.13241.76±15.08模型組65.89±4.17*43.47±4.13*合劑低劑量組60.36±4.65*53.10±5.98*合劑中劑量組55.27±3.54*#△63.71±6.13*合劑高劑量組50.01±3.17*#△▲79.45±5.25*#△▲

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與合劑低劑量組比較，ΔP<0.05；與合劑中劑量比較，▲P<0.05。

2.2 各組大鼠 BALF中IL-4、IFN-γ含量比較

與對照組相比，模型組大鼠BALF中IL-4含量明顯升高，IFN-γ含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示CVA發(fā)病與IL-4、IFN-γ含量有密切關系；經(jīng)治療后，與模型組比較，各組大鼠的IL-4含量均有不同程度降低，IFN-γ值均有不同程度升高(P<0．05)，合劑高劑量組指標改善情況最為顯著，說明合劑高劑量組對BALF中IL-4、IFN-γ含量的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于其他各組。見表2。

組別IL-4IFN-γ正常對照組11.80±0.67468.76± 34.08模型組25.89±0.85*163.47±24.13*合劑低劑量組24.36±0.95*183.10±25.98*合劑中劑量組15.27±0.54*#△313.71±26.13*合劑高劑量組14.01±0.87*#△▲397.45± 25.25*#△▲

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與合劑低劑量組比較，ΔP<0.05；與合劑中劑量組比較，▲P<0.05。

3 討論

咳嗽變異型哮喘的發(fā)病機理與Th細胞有密切關系，而Th細胞又有Th1亞群和Th2亞群?，F(xiàn)代研究表明，Th1分泌的IFN-γ細胞因子減少，而Th2分泌的IL-4、IL-5、IIL-13細胞因子增多是哮喘發(fā)病的關鍵機制，Th1/Th2失衡可能是支氣管哮喘發(fā)病的一個重要環(huán)節(jié)，或始動因素[7]。在Th1、Th2分泌的細胞因子中，IL-4和IFN-γ是一對作用機制相反的細胞因子，在哮喘發(fā)病中起到重要作用。

中醫(yī)對哮喘的研究由來已久，《傷寒論》中已有“太陽病，下之微喘者，表未解故也，桂枝加厚樸杏子湯主之”及“喘家，作桂枝湯，加厚樸、杏子佳”的記載，可見，古代醫(yī)家已有應用桂枝加厚樸杏子湯治療哮喘的先例。本研究所用合劑由桂枝湯加厚樸、杏子、黨參、麥冬等組成，方中桂枝合生姜共奏發(fā)汗解表化濕之功，以解除衛(wèi)分邪氣；桂枝合白芍以調(diào)和營衛(wèi)；甘草、大棗扶助正氣、補益生化之源[8]；黨參、麥冬益氣潤肺；厚樸行氣消痰除滿；杏仁入肺以止咳平喘，全方共奏解肌祛表、益氣扶正、行氣止咳平喘之效。根據(jù)現(xiàn)代研究[9，10]，桂枝湯在調(diào)和營衛(wèi)，提高人體免疫機能及止痛鎮(zhèn)靜方面具有良好作用；而厚樸不僅具有廣泛的抗菌作用，還能使支氣管平滑肌舒張并能麻痹運動神經(jīng)末梢，從而達到松弛肌肉的目的；杏仁中含有的氫氰酸能鎮(zhèn)靜呼吸中樞，小劑量便可平靜呼吸起到止咳平喘的作用。

本實驗研究結(jié)果表明，和衛(wèi)溫肺合劑通過調(diào)節(jié)CVA模型大鼠血清及BALF中IFN-γ和IL-4含量，從而發(fā)揮治療CVA的作用，就療效來說優(yōu)于其他對照組。與模型組相比，各治療組均可不同程度降低大鼠血清及BALF中IL-4含量并提高IFN-γ含量，說明和衛(wèi)溫肺合劑可降低機體血清及BALF中IL-4水平，提高IFN-γ含量，以調(diào)控 Th1/Th2水平，達到緩解臨床癥狀、控制哮喘的目的。由于中藥復方作用的復雜性，雖然本實驗研究結(jié)果表明和衛(wèi)溫肺合劑可調(diào)控 Th1/Th2水平，但更深層次的調(diào)節(jié)機制尚不完全明確，仍待進一步研究。