張永平，吳琴琴，徐 麗，李 琴，余慧娟

(貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003)

支氣管哮喘(Bronchial Asthma)是一種由T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞和中性粒細胞等多種炎癥細胞參與的慢性氣道炎癥性疾病。氣道炎癥是其最為重要的病理特征之一，是目前公認的支氣管哮喘發(fā)病的重要因素。HMGB1是一個新近發(fā)現(xiàn)的具有顯著促炎作用的炎癥因子，與多種炎癥性疾病的病理生理過程息息相關。有臨床研究報道，在哮喘患者的痰和血漿中HMGB1的水平明顯增加，且痰中HMGB1的表達水平與肺功能指標呈明顯的負相關，這提示HMGB1可能參與了哮喘氣道慢性炎癥反應的過程[1]。苗藥熱咳喘膠囊由貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院治療哮喘經(jīng)驗方所制成，經(jīng)長期臨床運用，療效顯著。本研究通過觀察哮喘大鼠肺泡灌洗液中EOS、NEU的計數(shù)及HMGB1含量，以了解HMGB1與哮喘氣道炎癥的相關性及苗藥熱咳喘膠囊對HMGB1的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性健康清潔級SD大鼠40只，體重 120～140 g，月齡6～9個月，由貴州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，飼養(yǎng)實驗室采光、通風良好，室溫(22±2) ℃，濕度為 60%～70%，自由進食、飲水，自由活動，分籠飼養(yǎng)，正常飼養(yǎng)5天后，觀察各籠大鼠無異常表現(xiàn)。

1.1.2 藥物及試劑 苗藥熱咳喘膠囊由貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科制備：全瓜蔞(真花休)15 g、法夏(科辣)12 g、黃芩(額嘎)15 g、百部(窩嘎單里、銳敗呆)15 g、炙僵蠶(崗阿大) 15 g、地龍9 g、青黛6 g、蛤粉6 g、橘紅12 g、炒葶藶子12 g、杏仁10 g、桑白皮12 g、紫苑15 g、天竺子10 g、麻黃10 g、炙甘草10 g，上方醇提制成膠囊劑，每粒含生藥2.76 g。0.9%氯化鈉注射液500 mL(貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號：A14122812-2)，醋酸地塞米松注射液5 mg(貴州光正制藥有限責任公司，批：140828)，OVA(美國Sigma公司)，Al(OH)3(上海分工生產(chǎn))，滅活百日咳桿菌疫苗(北京生物制品研究所)，磷酸緩沖液(PBS)北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，大鼠HMGB1 ELISA試劑盒96T(北京中衫金橋生物技術有限公司)，兩用型水箱(BDS北京醫(yī)療器械設備廠)，自制塑料霧化箱30 cm×30 cm×45 cm，電熱恒溫水箱(HHW21420型湖北亞光醫(yī)用電子技術有限公司)，手術中所用的器械(止血鉗、鑷子、眼科剪等貴州中醫(yī)藥大學北校區(qū)實驗室)，醫(yī)用超聲霧化器貝爾斯BSW-2A(河北貝爾斯科技有限公司)，普通冰箱(中科美菱低溫科技有限責任公司)，電子天平(JY2001上海浦春計量儀器有限公司)，-4 ℃低溫冰箱(Thermo Scientific公司)。

1.1.4 動物分組 40只雄性SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、苗藥熱咳喘膠囊組、地塞米松組，每組各10只。

1.2 研究方法

1.2.1 哮喘模型建立 除正常對照組外，參照呂國平等人[2]的方法，并加以改進進行造模。實驗第1天，大鼠腹腔注射10%卵蛋白生理鹽水抗原液(內(nèi)含卵蛋白OVA100 mg，氫氧化鋁(Al(OH)3)100 mg，滅活百日咳菌苗5×109個)1 mL進行致敏，第8天重復上述操作。第15天腹腔注射后將大鼠放到霧化箱中，采用濃度為5% OVA溶液15 mL以超聲霧化吸入的方式激發(fā)大鼠哮喘發(fā)作，每天激發(fā)1次，每次持續(xù)時間為30 min，共激發(fā)7天。大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸急促、煩躁不安、弓背、抽搐或者跌倒等癥狀，說明哮喘模型激發(fā)成功。

1.2.2 給藥方法 正常組：第1天、第8天、第15天腹腔注射生理鹽水1 mL，第15天開始每次激發(fā)前1 h予生理鹽水3 mL灌胃，連續(xù)7天；模型組：第15天開始每次激發(fā)前1 h予生理鹽水3 mL灌胃，連續(xù)7天；地塞米松組：第15天起開始每次激發(fā)前1 h予醋酸地塞米松注射液50 μg/mL 3 mL(根據(jù)人鼠使用劑量換算，按1 mg/kg/d)腹腔注射，療程為2周；苗藥熱咳喘膠囊組：按照人鼠用藥劑量換算，第15天起每次激發(fā)前1h予熱咳喘膠囊2.10 g/kg，予熱咳喘膠囊粉配制后灌胃，3 mL/只/次，療程為2周。

1.2.3 BALF的提取 每組大鼠在療程結束后，腹腔注射10%水合氯醛以0.35 mL/100 g進行麻醉，麻醉好后，將大鼠仰臥固定于固定架上，股動脈放血處死，酒精消毒頸部及胸部，在超凈工作臺內(nèi)以無菌器械打開胸腔，完整分離心肺，分離氣管及左、右主支氣管，并結扎右側(cè)主支氣管。在氣管的第二、三軟骨環(huán)間做一個橫行切口，置入連接注射器的硅膠管，然后用“0”號手術線結扎固定，用一次性注射器將2.5 mL生理鹽水緩慢注入氣管和左側(cè)肺當中，氣管插管約0.5 cm，停留約30 s后緩慢抽回，以上動作重復操作5次，最后將5次抽取的BALF混合(回收率在85%以上為合格)。在4 ℃低溫下10 000 rpm離心5 min，取上清液后放至-4 ℃冰箱保存。

1.2.4 BALF中EOS及NEN計數(shù) 將正常組及模型組支氣管肺泡灌洗液細胞沉淀從-4 ℃冰箱取出，先用磷酸緩沖液(PBS)重懸BALF細胞懸液，然后取出來50 μL進行涂片，在涂片干燥以后再進行瑞氏(Wright-stain)染色，然后計數(shù)200個白細胞作分類計數(shù)，至少進行4個視野的計數(shù)(在光學顯微鏡下)，將細胞分為EOS、NEU、淋巴細胞和單核巨噬細胞(依據(jù)形態(tài)學特點)，最后計算BALF中EOS及NEU數(shù)量。

1.2.5 BALF中HMGB1含量的測定 正常組、模型組、苗藥熱咳喘膠囊組及地塞米松組均根據(jù)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒說明書進行操作，依據(jù)吸光度OD值計算出BALF標本中HMGB1的含量。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行處理，所有結果以均數(shù)±標準差進行表示，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。如果是多組正態(tài)資料的均數(shù)比較選方差分析，如果是兩兩多重比較選LSD法。

2 結果

2.1 肺泡灌洗液中EOS、NEU計數(shù)及HMGB1含量

正常組與模型組肺泡灌洗液中EOS、NEU計數(shù)及HMGB1含量比較，正常組均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。

組別nEOS(×109/L)NEN(×109/L )HMGB1(μg/L)正常組100.09±0.0091.20±0.4223.726±1.320模型組100.29±0.023▲6.40±1.838▲14.658±0.843▲

注：與正常組比較，▲P<0.05。

2.2 肺泡灌洗液中HMGB1含量

與正常組比較，模型組、苗藥熱咳喘膠囊組、地塞米松組BALF中HMGB1含量明顯高于正常組，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，苗藥熱咳喘膠囊組、地塞米松組均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與苗藥熱咳喘膠囊組比較，地塞米松組低于苗藥熱咳喘膠囊組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 BALF中HMGB1含量結果從高到低依次為：模型組、苗藥熱咳喘膠囊組、地塞米松組、正常組。見表2。

組別nHMGB1含量正常組模型組苗藥熱咳喘組地塞米松組101010103.726±1.32014.658±0.843▲5.895±0.929▲●5.459±0.842▲●Δ

注：與正常組比較，▲P<0.05；與模型組比較，●P<0.05；與苗藥熱咳喘膠囊組比較，ΔP>0.05。

3 討論

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等多種細胞參與的慢性氣道炎癥性疾病，伴有氣道高反應性、氣道阻塞和氣道重塑[3]。其基本特征是氣道高反應性炎癥、微血管滲漏、黏液分泌增加和平滑肌收縮所導致的可逆性氣道阻塞及氣道高反應性。氣道的慢性炎癥反應促使氣道結構改變，最終導致氣道重塑使哮喘癥狀發(fā)生及進一步發(fā)展[4]。而氣道慢性炎癥以EOS浸潤為主，EOS是支氣管哮喘氣道炎癥中十分關鍵的效應細胞，EOS能夠在氣道中聚集并活化進而引起哮喘的發(fā)病。而HMGB1是一種重要的炎癥介質(zhì)，近年來研究顯示HMGB1可能參與多個呼吸系統(tǒng)疾病的病理生理過程，在哮喘等慢性炎癥氣道疾病的地位也越來越受到人們的重視[5]。有文獻報道，HMGB1可以使EOS活化，并能夠提高EOS的存活時間[6]。有臨床研究報道，在哮喘患者的痰和血漿中HMGB1的水平明顯增加，且痰中HMGB1的表達水平與肺功能指標呈明顯的負相關，這提示HMGB1可能參與了哮喘氣道慢性炎癥反應的過程[1]。

苗藥熱咳喘膠囊是貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院治療支氣管哮喘的經(jīng)驗方，多年來臨床實踐證實對治療哮病熱哮證有顯著療效。經(jīng)現(xiàn)代藥理學研究證實，方中瓜蔞提取物中天門冬氨酸能增強細胞免疫活性，減輕炎癥反應，減少痰液的分泌，半胱氨酸能裂解痰液黏蛋白，使痰液變稀促進痰液排出[7]。麻黃中含有較多麻黃堿，偽麻黃堿能緩解支氣管平滑肌痙攣[8]。地龍富含氨基酸及多種礦物質(zhì)和微量元素，能顯著增強細胞表面Fc受體的功能，可以阻止EOS激活[9]。桑白皮在呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)為抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘的作用[10]?？嘈尤手兴目嘈尤受辗纸獬鰜淼臍淝杷崮軌蚴购粑由?，使咳嗽減輕[11]。葶藶子內(nèi)的芐基芥子油具有抗菌作用，能夠緩解平滑肌痙攣[12]。半夏所含β-谷甾醇具有止咳、抗癌、抗炎及降低血液中膽固醇的作用，可以減少支氣管分泌物從而起到鎮(zhèn)咳祛痰的作用[13]。黃芩能不同程度抑制細菌和病毒，也能夠提高機體的殺菌力[14]。黃芩、百部共用能夠使黃芩總黃酮和黃芩苷的含量增多，進而增強清熱、抗炎的作用。蛤粉富含豐富的氨基酸和多種微量元素，如谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸及鈣、鋅、鐵等，且蛤蚧身和尾的醇提取物具有明顯抗炎、解痙、平喘作用。橘紅中的橘紅多糖可以止咳化痰。百部主要成分為百部堿，有中樞性鎮(zhèn)咳的作用，其作用強度與氨茶堿類似，緩慢而持久?，F(xiàn)代藥理研究表明，甘草具有抗炎、抗氧化、抗病毒、治療多種呼吸系統(tǒng)疾病、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強免疫功能等功能，還能保護發(fā)炎的咽喉和氣管黏膜。

本研究結果表明，模型組肺泡灌洗液中EOS、NEU計數(shù)及HMGB1含量均明顯高于正常組，苗藥熱咳喘膠囊組、地塞米松組肺泡灌洗液中HMGB1含量明顯低于模型組，以上說明HMGB1與哮喘發(fā)生相關，其可能參與了哮喘氣道炎癥的形成，苗藥熱咳喘膠囊和地塞米松均能抑制哮喘大鼠氣道中HMGB1的表達。由于時間和大鼠樣本量有限，故本研究結果仍需大樣本的隨機對照研究加以證實。