劉金美，胡德分，丁培超，崔瓊芳，周明月，余顯倫,＊

（1.昭通市天麻研究院，云南昭通 657000；2.勐臘海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，云南勐臘 666300；3.昭通市天麻特產(chǎn)局，云南昭通 657000）

天麻（Gastrodia elata Bl.）為蘭科天麻屬植物的干燥塊莖，是一味名貴中藥材，具有息風(fēng)止痙、平肝潛陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，藥理作用有抗痙攣、抗驚厥、鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、促智抗衰老、增加腦血流量、改善供血、神經(jīng)保護(hù)等。臨床多用于頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇、抽搐、破傷風(fēng)等癥。

目前，昭通市場(chǎng)上的天麻產(chǎn)品除了少量的藥品和保健品外，大部分以鮮天麻和初加工產(chǎn)品（如天麻片，干天麻和天麻粉）進(jìn)行銷售，通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)，鮮天麻的初加工過程，大部分是在各產(chǎn)地由麻農(nóng)自己加工，由于受加工和檢測(cè)條件的限制，無法測(cè)定天麻素的含量，僅憑天麻的外觀判斷其品質(zhì)。因加工方法的不同，加工出來的天麻初加工產(chǎn)品質(zhì)量差異較大[1-3]。李德勛等[4]調(diào)查和考察昭通天麻傳統(tǒng)加工工藝時(shí)發(fā)現(xiàn)，影響天麻藥材中天麻素含量的因素為烘烤溫度。袁勝浩等[5]研究天麻中天麻素含量的影響因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，天麻素含量經(jīng)炮制后明顯增高，蒸制是提高天麻素含量最有效的方法，隨蒸制溫度升高，天麻素含量增加；除此之外，天麻素含量還與烘烤的溫度有關(guān)，具體的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。徐頂巧等[6]研究表明，對(duì)于鮮天麻在干制過程中各因素對(duì)天麻素含量的影響順序?yàn)楹娓蓽囟龋菊糁髸r(shí)間＞放置時(shí)間，且隨溫度升高，天麻素含量增加。但是溫度也不是越高越好，季德等[7]研究發(fā)現(xiàn)溫度過高，天麻內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)空心，表皮會(huì)有起泡現(xiàn)象。因此，為了指導(dǎo)藥農(nóng)正確的掌握天麻加工技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)參照傳統(tǒng)的天麻藥材加工方法，考察加工溫度對(duì)昭通天麻初加工產(chǎn)品的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量的影響。

1 儀器和試劑材料

1.1 儀器

島津LC-20AT型高效液相色譜儀（SPD-20A 型紫外檢測(cè)器）（島津企業(yè)管理（中國）有限公司）；FST-PF-UP菲爾普斯超純水儀；CP124C電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SK250LHC超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；JP-500C-8高速多功能粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司）。

1.2 試劑材料

1.2.1 試劑

天麻素和對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品，生產(chǎn)廠家為南京森貝伽生物科技有限公司；乙腈、甲醇，均為色譜純（64271 Darmstdt，Merck KGaA 德國公司）；無水乙醇（AR），生產(chǎn)廠家為成都市科隆化學(xué)品有限公司；磷酸（AR），生產(chǎn)廠家為重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司。

1.2.2 材料

鮮天麻樣品，2016年11月4日采自昭通市彝良縣小草壩烏葩嶺。

2 方法

2.1 樣品處理方法

2.1.1 樣品前處理

將采挖回來的無病蟲害、無傷的鮮天麻洗凈，晾干水分，測(cè)定鮮重，常壓蒸制透心。

2.1.2 天麻片樣品處理方法

天麻片樣品處理方法見表1。

2.1.3 天麻樣品處理方法

天麻樣品處理方法見表2。

表1 天麻片樣品處理方法

2.2 檢測(cè)方法

2.2.1 色譜條件

填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：220 nm；理論塔板數(shù)按天麻素峰值計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

表2 天麻樣品處理方法

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將天麻素和對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品于105 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥1 h，分別精密稱定天麻素對(duì)照品5 mg、對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品 2.5 mg，置于 100 mL 容量瓶中，加乙腈-水（3∶97）混合溶液制成每1 mL含天麻素50 μg、對(duì)羥基苯甲醇25 μg的混合溶液，作為天麻素對(duì)照品和對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取天麻素對(duì)照品和對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品儲(chǔ)備液 2、4、6、8、10 mL 分別置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈-水（3∶97）混合溶液稀釋至刻度，由此配成天麻素濃度為10、20、30、40、50 μg/mL和對(duì)羥基苯甲醇濃度為5、10、15、20、25 μg/mL的5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 樣品溶液的制備

取天麻樣品粉末（過三號(hào)篩），精密稱取2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率 120 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干無醇味，殘?jiān)右译?水（3∶97）混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用乙腈-水（3∶97）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，備用。

2.3 測(cè)定方法

參照《中國藥典》2015年版第四部的通則0512項(xiàng)[8]，采用高效液相色譜法測(cè)定天麻素和對(duì)羥基苯甲醇。天麻素和對(duì)羥基苯甲醇總含量不得少于0.25%。多組間比較采用SPSS 20.0系統(tǒng)分析軟件One-way AVONA方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 對(duì)照樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，天麻素線性回歸方程為Y=17 521.5X-17 619.8（r=0.999 9），對(duì)羥基苯甲醇線性回歸方程為 Y=30 618.3X-36 237.6（r=0.999 9），天 麻 素 濃度在10.00～50.00 μg/mL和對(duì)羥基苯甲醇濃度在5.00～25.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一供試品溶液，于 0、2、4、6、8、12、24 h各進(jìn)樣1次，測(cè)得天麻素濃度分別為48.198、47.973、48.185、48.163、48.201、48.206、48.212 μg/mL，RSD為0.18%；對(duì)羥基苯甲醇濃度為23.372、22.986、23.412、23.403、23.392、23.336、23.384 μg/mL，RSD為0.65%。說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.2 精密度試驗(yàn)

取天麻素和對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，以天麻素和對(duì)羥基苯甲醇濃度進(jìn)行計(jì)算，RSD為0.45%，說明儀器精密度良好。

3.2.3 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一天麻樣品1 g，共5份，分別精密加入等量的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，檢測(cè)天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量，測(cè)得天麻素的平均加樣回收率為99.5%，RSD為3.63%；測(cè)得對(duì)羥基苯甲醇的平均加樣回收率為99.7%，RSD為2.83%。

3.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取同一天麻樣品粉末5份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，檢測(cè)天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量，其RSD分別為1.86%和2.30%。

3.3 不同加工溫度對(duì)天麻初加工產(chǎn)品天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量的影響

3.3.1 不同加工溫度對(duì)鮮天麻成片的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量的影響

鮮天麻洗凈，蒸制后切成縱片，置于實(shí)驗(yàn)方案中預(yù)設(shè)的恒溫和變溫溫度烘干，測(cè)定結(jié)果如表3所示。在變溫條件下，以先65 ℃后50 ℃（表3P6）烘干的天麻片天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量之和最高，為0.6118%；恒溫條件下，以55 ℃（表3P2）烘干的天麻片天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量之和較高，為0.4854%，天麻片在設(shè)置的恒溫溫度下，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量之和隨著溫度的升高呈先升后降的趨勢(shì)。各組之間天麻素含量和對(duì)羥基苯甲醇含量存在顯著性差異。

3.3.2 不同加工溫度對(duì)干天麻的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量的影響

鮮天麻洗凈、蒸制后，置于實(shí)驗(yàn)方案中預(yù)設(shè)的恒溫和變溫溫度條件下烘干，檢測(cè)結(jié)果如表4所示。恒溫條件下，在所設(shè)的溫度范圍內(nèi)，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量隨溫度的升高而增加，以65 ℃（表4中K4）烘干天麻的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量之和最高，為0.6945%；同時(shí)，天麻素的含量是隨溫度的升高而增加，以65℃（表4中K4）烘干天麻的天麻素的含量最高，值為0.5701%；變溫條件下，以先50 ℃后65 ℃（表4中K5）烘干天麻的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量之和最高，為0.6812%，天麻素含量以65 ℃（表4中K5）最高，為0.4846%。各組之間天麻素含量和對(duì)羥基苯甲醇含量存在顯著性差異。

表3 不同溫度干天麻片天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量統(tǒng)計(jì)表（%，n=3）

表4 不同溫度干天麻中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量統(tǒng)計(jì)表（%，n=3）

4 結(jié)論

綜上所述，恒溫條件下，天麻片的干燥溫度以55℃為最佳溫度；變溫條件下，以先65 ℃后50 ℃為最佳加工溫度；干天麻的干燥溫度以65 ℃和先50 ℃后65 ℃為最佳溫度。溫度如若再高，天麻片會(huì)出現(xiàn)焦黃的現(xiàn)象，天麻片邊卷曲；天麻在短時(shí)間內(nèi)迅速脫水，天麻表皮會(huì)出現(xiàn)褶皺多而深、內(nèi)部空心和起泡現(xiàn)象；溫度到達(dá)65 ℃時(shí)，無論是天麻片還是干天麻，天麻素含量才有明顯增加的趨勢(shì)。季德等[7]研究結(jié)果表明：微波干燥組、微波紅外聯(lián)用組天麻素含量顯著增高，對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷含量減少，說明較高溫度會(huì)引起成分間的相互轉(zhuǎn)化，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與這一結(jié)論相一致，但天麻素和對(duì)羥基苯甲醇及其他有效成分之間的轉(zhuǎn)化機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。