楊財(cái)容，茍麗萍，葉美金，祁偉亮，劉松青

（成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 611130）

近年來，國(guó)內(nèi)外關(guān)于真菌多糖及其復(fù)合物所具有的生物活性以及生物學(xué)功能是一大熱點(diǎn)內(nèi)容，同時(shí)隨著對(duì)真菌多糖的提取方法、生理功能、制備合成、以及藥理學(xué)等研究的深入，現(xiàn)已取得了明顯的成就。目前，關(guān)于茶樹菇多糖的提取方法以傳統(tǒng)的熱水浸提法[1-3]為主，傳統(tǒng)熱水浸提法雖然操作簡(jiǎn)便，不需要特殊設(shè)施，提取工藝成本也較低，但普遍存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低、產(chǎn)物雜質(zhì)多等問題。韋藤幼[4]提出了植物有效成分的解吸-熱提兩步提取法即內(nèi)部沸騰法，該方法是先用少量的低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑將提取物料完全浸潤(rùn)后，加入溫度高于有機(jī)溶劑沸點(diǎn)的提取劑提取一段時(shí)間。內(nèi)部沸騰法的原理是高溫度的提取劑使?jié)B透到物料內(nèi)部的低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑發(fā)生內(nèi)部沸騰引起對(duì)流擴(kuò)散，從而將被提組分挾帶至提取溶劑內(nèi)，達(dá)到強(qiáng)化提取的效果[4]。目前，內(nèi)部沸騰法已被應(yīng)用于多種植物有效成分的提取中，如香菇[5]、金銀花[6]、火龍果果皮[7]、壺瓶棗[8]等中多糖類物質(zhì)的提取，松針[9]中有機(jī)酸類物質(zhì)的提取，銀杏葉[10]黃酮類物質(zhì)的提取，結(jié)果表明內(nèi)部沸騰法是一種提取速率快、提取率高并且產(chǎn)物雜質(zhì)少的提取方法。

內(nèi)部沸騰法現(xiàn)已應(yīng)用于香菇多糖的提取工藝中，但未見其在茶樹菇多糖提取工藝方面的運(yùn)用，因此本試驗(yàn)以茶樹菇為原料，選擇乙中醇為解吸劑，蒸餾水為提取劑，主要考察乙醇用量、乙醇濃度、乙醇解吸時(shí)間、用水量與物料的比例（液料比）、提取溫度、提取時(shí)間六個(gè)影響因素對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響，通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)探究?jī)?nèi)部沸騰法提取茶樹菇多糖的最佳工藝條件，為茶樹菇多糖的開發(fā)、利用提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樹菇子實(shí)體干品，購(gòu)于成都永輝超市，產(chǎn)于四川省青川縣；葡萄糖（AR）；無水乙醇（AR）；苯酚（AR）；濃硫酸（AR）。

1.2 主要儀器設(shè)備

JA1203B型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）、A550型九陽粉碎機(jī)（九陽股份有限公司）、UV-2102型紫外分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）、SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）、DHG-9123A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、DHG-9123A型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

茶樹菇預(yù)處理（烘干、粉碎、過篩）→乙醇解吸→熱水浸提→減壓抽濾→茶樹菇多糖提取液→茶樹菇多糖含量測(cè)定→茶樹菇多糖提取率計(jì)算。

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）茶樹菇預(yù)處理：將茶樹菇置于恒溫干燥箱中烘干，烘干后用九陽粉碎機(jī)粉碎得到茶樹菇粉末。

（2）乙醇解吸：精確稱取1.00g茶樹菇粉末于燒杯中，用一定濃度、一定量的乙醇溶液充分滲透茶樹菇粉末，并解吸一定時(shí)間。

（3）熱水浸提：乙醇解吸完成后立即加入一定溫度、一定量的蒸餾水，恒溫?zé)崴嵋欢〞r(shí)間。

（4）減壓抽濾：將經(jīng)熱水浸提后的上清液減壓抽濾至100mL容量瓶中，并用蒸餾水洗滌茶樹菇粉末殘?jiān)?～3次，將洗滌液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線，得到茶樹菇提取液。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取18組茶樹菇粉末，每組5份，每份1.00g，將茶樹菇粉末用5mL的40%乙醇溶液解吸25min后加入液料比為15∶1溫度為90℃的蒸餾水提取5min。1組5份，分別對(duì)應(yīng)1個(gè)單因素試驗(yàn)中的5個(gè)水平，每個(gè)單因素進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，每個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)完成后得到3組共計(jì)15份多糖提取液。其中乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置的5個(gè)考察水平分別為20%、30%、40%、50%、60%；乙醇用量設(shè)置的5個(gè)考察水平分別為3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL；解吸時(shí)間設(shè)置的5個(gè)考察水平分別為10min、15min、20min、25min、30min；液料比設(shè)置的5個(gè)考察水平分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1；提取溫度設(shè)置的5個(gè)考察水平分別為80℃、85℃、90℃、95℃、100℃；提取時(shí)間設(shè)置的5個(gè)考察水平分別為5min、6min、7min、8min、9min。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，從6個(gè)影響因素中選取3個(gè)主要因素，設(shè)計(jì)L9（33）即3因素3水平正交試驗(yàn)，平行3次試驗(yàn)得到27組多糖提取液，通過對(duì)提取液中多糖含量及提取率的測(cè)定和計(jì)算，使用SPSS19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，分析數(shù)據(jù)后得出內(nèi)部沸騰法提取茶樹菇多糖的最佳工藝參數(shù)組合。

1.4 分析方法

1.4.1 多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法

參考SN/T4260-2015出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定[11]完成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，得回歸方程為Y=0.5369X+0.192（R2=0.9992）。

取茶樹菇多糖提取液1mL于100mL容量瓶中稀釋定容，移取1mL稀釋液置于50mL比色管，參照香菇中粗多糖含量測(cè)定方法[12]測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算茶樹菇多糖提取液中的含糖量。

1.4.2 多糖提取率計(jì)算

根據(jù)公式（1）計(jì)算茶樹菇多糖提取率。

式（1）中，M1：測(cè)得的茶樹菇多糖含量（mg）；V1：茶樹菇多糖提取液定容體積（mL）；N：多糖提取液稀釋倍數(shù)，100倍；V2：測(cè)定吸光度時(shí)移取多糖提取液的體積（mL）；M2：茶樹菇粉末質(zhì)量（g）；0.9：將葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

由圖1可知，茶樹菇多糖提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)的5個(gè)水平間多糖提取率變化范圍在7.70%～11.97%，各水平間效果差異明顯，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響多糖提取率的主要因素之一。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，反應(yīng)體系中乙醇含量少，內(nèi)部沸騰強(qiáng)度低，多糖提取率僅有7.70%。增加乙醇體積分?jǐn)?shù)后，反應(yīng)體系中的乙醇含量增加，內(nèi)部沸騰強(qiáng)度增大，多糖提取率增加。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)，多糖提取率最大為11.97%，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，由于多糖不溶于高濃度的乙醇，多糖溶解度開始降低，提取率也隨之降低。因此初步確定本實(shí)驗(yàn)中乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)為40%左右。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

2.1.2 乙醇用量對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇用量的增加茶樹菇多糖提取率先增加后逐漸趨于穩(wěn)定，在乙醇用量的5個(gè)水平間多糖提取率變化范圍在10.33%～12.41%，效果差異不明顯，因此乙醇用量為次要因素。當(dāng)乙醇用量為3mL時(shí)，乙醇溶液不能完全浸潤(rùn)茶樹菇樣品粉末，解吸不充分影響多糖溶出，多糖提取率較低；當(dāng)增加乙醇用量后，乙醇溶液能完全滲透到茶樹菇內(nèi)部，利于多糖溶出，多糖提取率增加。當(dāng)乙醇用量增加至5mL后繼續(xù)增加乙醇用量，多糖提取率趨于平穩(wěn)，說明乙醇解吸作用已基本達(dá)到飽和。從節(jié)約資源的角度考慮，本實(shí)驗(yàn)最佳乙醇用量為5mL。

圖2 乙醇用量對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

2.1.3 解吸時(shí)間對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

如圖3所示，茶樹菇多糖提取率隨著解吸時(shí)間的增加而增加，在解吸時(shí)間5個(gè)水平間多糖提取率由7.1%增至13.21%，各水平間的效果差異明顯，解吸時(shí)間是影響茶樹菇多糖提取率的主要因素之一。當(dāng)解吸時(shí)間為10min時(shí)，解吸時(shí)間短，反應(yīng)體系中乙醇溶液和茶樹菇粉末接觸不充分，多糖提取率僅有7.1%，增加解吸時(shí)間后乙醇滲透充分，解吸越來越充分，多糖提取率增加，當(dāng)解吸時(shí)間為25min時(shí)多糖提取率為12.95%，解吸時(shí)間繼續(xù)增加至30min時(shí)，多糖提取率為13.21%，多糖提取率的增幅速率較小但仍有增加的趨勢(shì)，因此還需增加大于30min的水平進(jìn)一步判斷本實(shí)驗(yàn)的最佳解吸時(shí)間。

圖3 解吸時(shí)間對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

2.1.4 液料比對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

由圖4可知，茶樹菇多糖提取率隨著的液料比的增大而升高，在液料比5個(gè)水平間多糖提取率由10.81%升至12.87%，相對(duì)其他影響因素液料比各水平間效果差異較小，為次要因素。當(dāng)液料比為10∶1時(shí)，用水量少，茶樹菇細(xì)胞胞內(nèi)的多糖溶出量低，多糖提取率較低；增加用水量后，多糖溶出加快，殘留在茶樹菇內(nèi)部的多糖減少，多糖提取率升高；當(dāng)用水量達(dá)到為物料的15倍后，繼續(xù)增加用水量，提取率僅有0.18%的變化，說明多糖提取已基本完全。同時(shí)，用水量過大會(huì)造成其他水溶性成分的溶出，從而影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度。因此本實(shí)驗(yàn)最佳液料比為15∶1。

圖4 液料比對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

2.1.5 提取溫度對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

由圖5可知，茶樹菇多糖提取率隨著提取溫度的升高先增加后降低，在提取溫度的5個(gè)水平間多糖提取率變化范圍在8.26%～14.46%，各水平間的差異變化明顯，提取溫度是影響茶樹菇多糖提取率主要因素之一。當(dāng)提取溫度為80℃時(shí)，提取溫度小于40%乙醇溶液的沸點(diǎn)83.1℃，乙醇不能發(fā)生沸騰，多糖溶出困難，多糖提取率僅有8.26%；增加提取溫度后，提取溫度大于40%乙醇的沸點(diǎn)，茶樹菇內(nèi)部發(fā)生沸騰，多糖分子以對(duì)流擴(kuò)散的方式大量擴(kuò)散到蒸餾水中，多糖提取率增加；當(dāng)提取溫度升至90℃時(shí)，茶樹菇多糖提取率達(dá)到14.46%；繼續(xù)升高溫度至100℃，多糖提取率出現(xiàn)下降，分析其原因可能是提取溫度過高，多糖分子因熱不穩(wěn)定性而產(chǎn)生分解，導(dǎo)致提取率出現(xiàn)下降。故初步判定本實(shí)驗(yàn)最佳提取溫度為90℃左右。

圖5 提取溫度對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

2.1.6 提取時(shí)間對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

由圖6可知，茶樹菇多糖提取率隨著提取時(shí)間的增加先升高后下降，在提取時(shí)間5個(gè)水平間，多糖提取率變化范圍在11.46%～14.97%，相對(duì)其他影響因素各水平間的效果差異較不明顯。當(dāng)提取時(shí)間為5min時(shí)，提取時(shí)間短，反應(yīng)體系中蒸餾水與茶樹菇接觸不充分，多糖提取率較低；當(dāng)增加提取時(shí)間，反應(yīng)體系中物料與試劑接觸越來越充分，多糖擴(kuò)散慢慢達(dá)到平衡，多糖提取率增加，提取時(shí)間增加為8min時(shí)有最大提取率；繼續(xù)增加提取時(shí)間，多糖提取率出現(xiàn)下降，分析原因可能是提取時(shí)間較長(zhǎng)，茶樹菇中其他非多糖類水溶性成分溶出，影響多糖溶出，提取率下降。因此，本實(shí)驗(yàn)中最佳提取時(shí)間為8min。

圖6 提取時(shí)間對(duì)茶樹菇多糖提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、解吸時(shí)間、提取溫度三個(gè)因素設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)。因素水平見表1，正交試驗(yàn)及結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

由表2中極差值R可知，B（解吸時(shí)間）＞C（提取溫度）＞A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）這說明在這三個(gè)考察因素的取值范圍內(nèi)，影響茶樹菇多糖提取率最主要的因素是乙醇解吸時(shí)間，提取溫度的影響次之，而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響最小。

由表2比較各因素間不同水平的效果值，對(duì)于因素A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）有k2＞k3＞k1說明A2水平的多糖提取率效果最佳，對(duì)于因素B（解吸時(shí)間）有k1＞k3＞k2說明B1水平的多糖提取率效果最佳，對(duì)于因素C（提取溫度）有k1＞k3＞k2說明C1水平的多糖提取率效果最佳。因此確定最佳因素水平組合為A2B1C1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、乙醇解吸時(shí)間25min、熱水浸提溫度為88℃。

表2 正交試驗(yàn)及極差分析結(jié)果

采用SPSS19.0軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，方差分析結(jié)果見表3。由表3中P值可知，PA=0.200＞0.05說明因素A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）在取值范圍內(nèi)對(duì)茶樹菇多糖提取效果差異不顯著；PB=0.017＜0.05說明因素B（解吸時(shí)間）在取值范圍內(nèi)對(duì)茶樹菇多糖提取效果存在差異性顯著；PC=0.034＜0.05說明因素C（提取溫度）在取值范圍內(nèi)對(duì)茶樹菇多糖提取效果存在顯著差異。

由PA=0.2＞0.05＞PC=0.034＞PB=0.017，說明因素B（解吸時(shí)間）差異顯著性大于因素C（提取溫度）的差異顯著性大于因素A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）的差異顯著性。結(jié)合F值檢驗(yàn)結(jié)果FB＞FC＞F0.05=19.164＞FA，同樣說明因素B（解吸時(shí)間）組間有顯著的差異，因素C（提取溫度）組間有顯著性差距，因素A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）組間無顯著性差異，同時(shí)因素B（解吸時(shí)間）差異性大于因素C（提取溫度）。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響更大，因此，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制乙醇解吸時(shí)間，要使茶樹菇物料被乙醇浸潤(rùn)完全，解吸充分，從而提高茶樹菇多糖提取率，以達(dá)到試驗(yàn)預(yù)期效果。

表3 方差分析結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)分析和正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，最終得出內(nèi)部沸騰法提取茶樹菇多糖的最佳工藝參數(shù)為：乙醇用量5mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、乙醇解吸時(shí)間25min、蒸餾水提取溫度88℃、蒸餾水用量為茶樹菇用量的15倍、蒸餾水提取時(shí)間8min，這樣的參數(shù)組合沒有出現(xiàn)在正交試驗(yàn)中，為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，按照上述最優(yōu)工藝參數(shù)提取茶樹菇多糖測(cè)定多糖提取率進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次測(cè)得茶樹菇多糖提取率分別為22.24%、22.14%、22.10%，平均值為22.16%，高于正交試驗(yàn)表中最大提取率20.16%，故認(rèn)為該組合是內(nèi)部沸騰法提取茶樹菇多糖的最佳工藝組合。在最優(yōu)提取工藝條件下，茶樹菇多糖提取率具有穩(wěn)定性，試驗(yàn)重復(fù)性較好，說明正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝是合理的。

2.4 內(nèi)部沸騰法與熱水提取法的比較

將最優(yōu)試驗(yàn)條件下提取的茶樹菇多糖提取率、提取時(shí)間、工藝參數(shù)等與傳統(tǒng)熱水浸提法相比較，結(jié)果如表4所示。

表4 內(nèi)部沸騰法與熱水浸提法的比較

（1）熱水浸提法提取茶樹菇多糖提取率為13.10%[3]，內(nèi)部沸騰法提取茶樹菇多糖提取率為22.16%，多糖提取率增加了69.16%。

（2）熱水浸提法提取一次需要4h[3]，而內(nèi)部沸騰法提取工藝整個(gè)流程僅需0.5h，極大的縮短了提取時(shí)間。

3 結(jié)論

本研究采用內(nèi)部沸騰法提取茶樹菇多糖，確定最佳提取工藝參數(shù)為乙醇用量5mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，乙醇解吸時(shí)間25min，液料比15∶1，提取溫度88℃，提取時(shí)間8min。在最佳提取工藝下，內(nèi)部沸騰法提取茶樹菇多糖的多糖提取率達(dá)到22.16%，與傳統(tǒng)熱水浸取法相比較多糖提取率提高了69.16%，提取時(shí)間縮短了3.5h，降低了蛋白質(zhì)、色素等其他非糖物質(zhì)的溶出機(jī)率。同時(shí)，內(nèi)部沸騰法提取茶樹菇多糖具有用時(shí)短、提取率高、雜質(zhì)少、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。