趙貫建，張翔，程遠(yuǎn)，王志剛，黃琴

0 引言

膠質(zhì)瘤是目前最常見的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其年發(fā)病率為6/105[1]，盡管目前大多采用手術(shù)切除、術(shù)后放療及化療的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案[2]，但膠質(zhì)瘤治療預(yù)后仍不佳[3]，5年生存率僅稍高于胰腺癌和肺癌，世界衛(wèi)生組織已將其定為最難治療的惡性腫瘤之一[4]，故目前迫切需要治療膠質(zhì)瘤的新方法。RNAi技術(shù)因其高度的特異性和安全性有望成為根治腫瘤的有效方式[5]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerves system, CNS）中，血腦屏障（blood brain barrier, BBB）阻止了約98%的小分子物質(zhì)和幾乎100%的生物大分子物質(zhì)進(jìn)入CNS，對維持神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起了重要作用，但同時(shí)也阻止了對CNS疾病起治療作用的藥物或者基因進(jìn)入其中[6]，如何實(shí)現(xiàn)靶基因shRNA跨過BBB轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞并抑制癌基因的表達(dá)是RNAi技術(shù)治療膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵。脂質(zhì)體作為一種細(xì)胞組成成分能通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)也能有效保護(hù)質(zhì)粒不被降解而成為一種理想的基因載體[7]。但傳統(tǒng)脂質(zhì)體由于粒徑大、攜帶負(fù)電荷及缺乏識別BBB的特異蛋白等原因，不能透過BBB將基因遞送至CNS內(nèi)，其在膠質(zhì)瘤治療中的使用也受到限制。

NGR是一種由天冬酰胺、甘氨酸、精氨酸人工合成的三肽（Asn-Gly-Arg），其靶向配體為表達(dá)于細(xì)胞表面的CD13。CD13是一種膜結(jié)合的金屬肽酶，是新血管生成的重要調(diào)節(jié)因子。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上CD13的表達(dá)較正常細(xì)胞及組織明顯增高，且這種高表達(dá)的CD13受體能夠特異性識別NGR，而表達(dá)于正常細(xì)胞和組織中的CD13沒有該功能[8]。我們擬通過碳二亞胺法將NGR連接到脂質(zhì)體上，利用NGR與CD13的結(jié)合促進(jìn)脂質(zhì)體跨過BBB或血瘤屏障（blood tumor barrier, BTB），從而使其攜帶的shRNA進(jìn)入靶細(xì)胞中。Birc5作為凋亡抑制因子中的一員，具有抑制凋亡、促進(jìn)血管生成以及與化療藥物耐藥相關(guān)等作用[9]。Birc5只在惡性腫瘤中表達(dá)而不表達(dá)于正常組織的特性使其成為絕佳的靶向基因[10]。所以，我們擬構(gòu)建一個(gè)含有Birc5 shRNA（shBirc5）的質(zhì)粒，使用lipo-NGR將其遞送至靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮RNAi效應(yīng)，以達(dá)到治療腫瘤的目的，從而為膠質(zhì)瘤提供一種新的治療方式。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙胺-羥基聚合物（DSPEPEG2K-COOH）、3β-[N-（N’, N’-二甲基胺乙基）甲酰基] 膽固醇（DC-chol）、1-（3-二甲氨基丙基）-3乙基碳二亞胺鹽（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸多肽（NGR），均購自美國Avanti公司。高純度質(zhì)粒大提試劑盒質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo被用來構(gòu)建Birc5的shRNA，購自廣州銳博生物技術(shù)公司。FA2004電子天平（上海精密儀器科學(xué)有限公司），VCX-130型聲振儀（美國Sonic公司），激光粒度分析儀（Zetasizer Nano ZS90），RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化器械公司），脂質(zhì)體擠出儀（美國Avanti公司）。shBric5-F序列為5'-GATCCCGCCGGATGACAACCCTATA G T T G A T A T C C G C-T A T A GGGTTGTCATCCGGTTTTTT-3'，shBirc5-R序列為5'-AGCTTTTGGAAAAAAACCGGATGA CAACCCTATAGCGGATATCAACTATAGGGT TGTCATCCGGCGG-3'，未添加shRNA序列的pRNAT-U6.1/Neo作為對照shControl。

1.2 微球的制備

使用電子天平精確稱取DPPC、DSPEPEG2K-COOH、DC-chol分別為5、2、1 mg于圓底燒瓶中。向圓底燒瓶中加入40 ml CDl3溶解混勻各脂質(zhì)體，將燒瓶安裝至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，50℃水浴5 min，持續(xù)水浴并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)40 min成膜。成膜成功后，向燒瓶中加入50℃水浴30 min的PBS緩沖液2 ml，使用聲振儀振蕩2 min。將所得到的脂質(zhì)體混懸液依次通過擠出儀上孔徑為800、400、200和100 nm的濾過膜即得到含有PBS的脂質(zhì)體微球（lipo）[11]。

1.3 NGR靶向載shBirc5脂質(zhì)體的制備

將上述制備的lipo用低溫離心機(jī)10 000 r/min離心8 min，使用pH=6.0的MES緩沖液重懸lipo，按摩爾比COOH:EDC:NHS=1:10:30向混懸液中加入NGR溶液（1 mg/ml）。將混懸液冰浴置于振蕩儀上80 r/min振蕩6 h，10 000 r/min離心8 min，重復(fù)3次后即得到lipo-NGR。向lipo-NGR中加入1.8 mg量shBirc5，利用正負(fù)電荷的吸引力使lipo-NGR與shBirc5連接，10 000 r/min離心5 min后即得到shBirc5-lipo-NGR[12]。光學(xué)顯微鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)，激光粒度分析儀測定各脂質(zhì)體的粒徑及電位。

1.4 建立SD大鼠原位C6細(xì)胞腫瘤模型

細(xì)胞的準(zhǔn)備：取對數(shù)生長期的C6細(xì)胞，制成濃度為1×108/ml的細(xì)胞懸液，冰浴備用。常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備、麻醉、備皮、固定及消毒。在頭皮正中沿身體長軸切開長約5 mm的切口，找到前囟點(diǎn)，于bregma點(diǎn)右側(cè)3 mm、前方1 mm處，使用電動(dòng)磨鉆鉆一小孔，微量注射器吸取C6細(xì)胞懸液10 μl，并固定到立體定向儀上，針尖對準(zhǔn)顱骨上的小孔并與硬腦膜接觸。扭動(dòng)定向儀上的旋鈕緩慢進(jìn)針，控制速度為1 mm/min，進(jìn)針5.5 mm后停留1 min，再向后退1 mm，緩慢將微量注射器內(nèi)的C6細(xì)胞注入SD大鼠腦組織中，速度約為1 μl/min，推注完畢后留針10 min。緩慢退針（1 mm/min），骨蠟涂抹顱骨進(jìn)針小孔后全層縫合手術(shù)切口。在種瘤后7、22天時(shí)行MRI T2加權(quán)像檢查腫瘤的形成情況（層厚0.8 mm），選取成瘤佳的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及觀察

將28只成瘤大鼠隨機(jī)分成4組。第1組（對照組）：尾靜脈注射2 ml 0.9%氯化鈉溶液；第2組（shBirc5-lipo組）：經(jīng)尾靜脈注入2 ml shBirc5-lipo；第3組（shControl-lipo-NGR組）：經(jīng)尾靜脈注入2 ml shControl-lipo-NGR；第4組（shBirc5-lipo-NGR組）：經(jīng)尾靜脈注射2 ml shBirc5-lipo-NGR。每組隨機(jī)抽取2只大鼠，處理后第10天，2 ml的1%戊巴比妥處死所有SD大鼠，灌洗后取出腦組織，切片后使用免疫組織化學(xué)法觀察腫瘤細(xì)胞Birc5蛋白表達(dá)情況。剩下的20只大鼠每隔5天行MRI T2加權(quán)像檢測，并按公式V腫瘤=[長（最大層面）×寬（最大層面]）×層數(shù)×0.8/2計(jì)算腫瘤大小。按公式V=V目前/V第7天得到腫瘤的生長速度。觀察大鼠的生存時(shí)間，在大鼠出現(xiàn)意識障礙、不能進(jìn)食時(shí)用2 ml 1%戊巴比妥處死大鼠，記錄當(dāng)天為大鼠經(jīng)治療后的生存時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shBirc5-lipo-NGR的制備及檢測

制得的lipo濃度為（5.02±0.23）×1011/ml，為粒徑均一的圓球形，見圖1，其粒徑和電位分別為（158.6±46.2）nm和（25.5±4.38）mV。lipo-NGR的平均粒徑為（165.6±46.59）nm，較lipo有所增加，但兩者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.901），lipo-NGR的表面電位為（28.9±4.68）mV，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.04）。說明NGR對lipo的粒徑影響小，而對其電位有明顯的增加作用。制得的lipo-NGR與過量的shBirc5充分反應(yīng)后，測得的粒徑為（186.2±74.07）nm，電位為（10.9±3.76）mV，見圖2。

2.2 原位膠質(zhì)瘤模型的建立

圖1 白光下顯微鏡顯示shBirc5-lipo-NGR的形態(tài)和大小Figure1 Shape and size of shBirc5-lipo-NGR observed by bright-f i eld microscopy

圖2 Zetasizer Nano ZS90測量lipo、lipo-NGR和shBirc5-lipo-NGR的粒徑和電位Figure2 Zeta potential and particle size of lipo, lipo-NGR and shBirc5-lipo-NGR measured by Zetasizer Nano ZS90

通過MRI T2加權(quán)像顯像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)腫瘤在成瘤后第7天時(shí)生長于大鼠右側(cè)大腦的基底節(jié)區(qū)，平均大小為（12.21±2.42）mm3，見圖3A。而成瘤后第22天，腫瘤幾乎占據(jù)了大鼠的整個(gè)右側(cè)大腦，正常的腦組織受壓嚴(yán)重，甚至對側(cè)腦組織也有輕微受壓偏移。其平均腫瘤大小為（273.42±36.37）mm3，證明SD大鼠原位C6細(xì)胞腫瘤模型構(gòu)建成功，見圖3B。

圖3 MRI T2像顯示種植C6細(xì)胞后原位腫瘤在第7天(A)和第22天(B)時(shí)的形成情況Figure3 Orthotopic tumor formation at 7(A) and 22 days(B) after implantation of C6 cells illustrated by T2-weighted MRI

2.3 shBirc5-lipo-NGR的靶向性

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，shBirc5-lipo-NGR組Birc5蛋白較對照、shBirc5-lipo、shControl-lipo-NGR組明顯減少。說明shBirc5-lipo-NGR在大鼠體內(nèi)能跨過BBB或者血瘤屏障（blood tumor barrier,BTB）進(jìn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并使其攜帶的shBirc5產(chǎn)生RNAi效應(yīng)，進(jìn)而抑制Birc5蛋白的表達(dá)，而shBirc5-lipo、shControl-lipo-NGR與Control組比較，Birc5無明顯減少，證實(shí)了NGR對新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向性，并且能對Birc5蛋白的表達(dá)發(fā)揮RNAi效應(yīng)，見圖4。

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測各組Birc5蛋白表達(dá)情況Figure4 Expression of Birc5 protein in each group showed by immunohistochemistry

2.4 shBirc5-lipo-NGR的體內(nèi)效應(yīng)

在成瘤后的第12、17和22天時(shí)，對照組腫瘤的平均體積是shBirc5-lipo-NGR組的4.7倍左右，說明shBirc5-lipo-NGR能夠抑制腫瘤的生長（P＜0.001)。而對照組分別與shBirc5-lipo和shControl-lipo-NGR組中腫瘤體積對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.459, P=0.468），見圖5、圖6A。對比腫瘤生長的速度也得出了相似的結(jié)果，見圖6B。對照、shBirc5-lipo、shControl-lipo-NGR和shBirc5-lipo-NGR組的中位生存期分別為21、22、24和30天，見圖7。分別與對照、shBirc5-lipo和shControl-lipo-NGR組比較，shBirc5-lipo-NGR組的中位生存時(shí)間明顯延長，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.010、0.010、0.005），證實(shí)了shBirc5-lipo-NGR能延長SD大鼠原位C6膠質(zhì)瘤生存期，且這種抑制作用是通過shBirc5介導(dǎo)的。

3 討論

RNAi技術(shù)因其能特異性的沉默靶基因mRNA抑制其蛋白的表達(dá)而成為近年基因編輯的研究熱點(diǎn)，其高度的特異性和安全性有望成為根治腫瘤的有效方式。RNAi技術(shù)主要包括siRNA、shRNA、dsRNA等幾種形式，相比于其他形式，shRNA具有性質(zhì)穩(wěn)定、能自我復(fù)制、抑制率高等特點(diǎn)而被廣泛使用[13]。

圖5 MRI T2相監(jiān)測大鼠植入C6細(xì)胞后腫瘤在7、12、17和22天時(shí)的生長情況Figure5 Tumors growth at 7, 12, 17 and 22 days after C6 cells implantation longitudinally monitored by T2-weighted MRI

在CNS疾病中，藥物或基因能夠透過BBB是其對疾病達(dá)到治療目的的前提，藥物或基因?qū)BB的通透性是由它的粒徑、電位、脂溶性及是否有受體介導(dǎo)決定的[14]。如何實(shí)現(xiàn)靶基因shRNA跨過BBB轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞并抑制癌基因的表達(dá)是RNAi技術(shù)治療膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)最終制得的shBirc5-lipo-NGR，其粒徑為（186.2±74.07） nm，為基因載體在腫瘤部位產(chǎn)生保留（enhanced permeability and retention, EPR）效應(yīng)[15]提供條件。為了提高轉(zhuǎn)染效率，用于基因轉(zhuǎn)染的納米粒帶少量正電荷或者不帶電荷[16]。本實(shí)驗(yàn)中制得的lipo-NGR經(jīng)激光粒度分析儀測得的電位為（28.9±4.68）mV，在與shBirc5充分結(jié)合后其電位降為（10.9±3.76）mV，利用電荷吸引能很好地與血管內(nèi)皮細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞結(jié)合，并為最終由NGR-CD13介導(dǎo)shBirc5-lipo-NGR跨過BBB或者BTB提供條件[17]。

NGR作為靶向因子，能特異性識別高表達(dá)CD13的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過其與靶蛋白CD13結(jié)合介導(dǎo)靶細(xì)胞對shBirc5-lipo-NGR的內(nèi)吞作用，進(jìn)而發(fā)揮RNAi效應(yīng)，同時(shí)達(dá)到了跨BBB和BTB的目的，為治療SD大鼠原位膠質(zhì)瘤提供條件[18]。

圖6 基于MRI T2相分析腫瘤大小(A)和生長速率(B)Figure6 Tumor volume(A) and its increase rate(B)analyzed by longitudinal T2-weighted MRI

圖7 不同處理組荷瘤大鼠生存曲線Figure7 Survival curves (Kaplan-Meier plot) of gliomabearing rats in different groups

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，為了證實(shí)shBirc5-lipo-NGR能對膠質(zhì)瘤發(fā)揮治療作用，我們使用MRI T2動(dòng)態(tài)監(jiān)測腫瘤的大小，并同時(shí)記錄了每只SD大鼠的生存時(shí)長。結(jié)果顯示shBirc5-lipo-NGR能明顯抑制腫瘤的生長和延長荷瘤大鼠的生存時(shí)長。而使用shBirc5-lipo或shControl-lipo-NGR均未對腫瘤的生長和生存期發(fā)揮明顯作用。相較于使用微泡開放BBB后應(yīng)用載體向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遞送基因，shBirc5-lipo-NGR具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）更簡潔的操作流程：使用shBirc5-lipo-NGR只需注射一次藥物，而使用微泡需至少注射兩次，并且需借助超聲來開放BBB；（2）更高的安全性：在超聲聯(lián)合微泡開放BBB的過程中，微泡量過多或者超聲強(qiáng)度過大，極易引起腦出血、肺栓塞等致死性并發(fā)癥，而使用大量shBirc5-lipo-NGR也不會出現(xiàn)這類并發(fā)癥。本研究中也存在一些不足，使用本新型靶向shBirc5脂質(zhì)載體并未達(dá)到治愈腫瘤的目的，這可能是因?yàn)槟z質(zhì)瘤細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上CD13受體量有限，相應(yīng)地限制了由其介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，從而使RNAi效應(yīng)發(fā)揮不完全。這是由細(xì)胞本身的特性決定的。另一方面，由于基因的異質(zhì)性，Birc5蛋白在腫瘤的生長過程中發(fā)揮的作用有限，還有許多其他的蛋白（比如TEM7、S100 A8和S100 A9蛋白等）具有促進(jìn)腫瘤生長的作用[19-20]。這種不足可以通過使用幾種在膠質(zhì)瘤生長過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白shRNA來加以克服[21]。

在本研究中，我們成功制備了靶向載shBirc5脂質(zhì)微球shBirc5-lipo-NGR，并將其應(yīng)用于SD大鼠原位膠質(zhì)瘤模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、MRI T2顯像等技術(shù)及手段證實(shí)了shBirc5-lipo-NGR對膠質(zhì)瘤的靶向性及抑制作用。靶向載基因脂質(zhì)微球因其能跨過BBB/BTB，有望作為膠質(zhì)瘤治療的一種新方法，但要將其成功應(yīng)用于臨床仍有大量工作需要完成。