趙貫建，張翔，程遠，王志剛，黃琴

0 引言

膠質(zhì)瘤是目前最常見的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其年發(fā)病率為6/105[1]，盡管目前大多采用手術(shù)切除、術(shù)后放療及化療的標準化治療方案[2]，但膠質(zhì)瘤治療預(yù)后仍不佳[3]，5年生存率僅稍高于胰腺癌和肺癌，世界衛(wèi)生組織已將其定為最難治療的惡性腫瘤之一[4]，故目前迫切需要治療膠質(zhì)瘤的新方法。RNAi技術(shù)因其高度的特異性和安全性有望成為根治腫瘤的有效方式[5]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerves system, CNS）中，血腦屏障（blood brain barrier, BBB）阻止了約98%的小分子物質(zhì)和幾乎100%的生物大分子物質(zhì)進入CNS，對維持神經(jīng)細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起了重要作用，但同時也阻止了對CNS疾病起治療作用的藥物或者基因進入其中[6]，如何實現(xiàn)靶基因shRNA跨過BBB轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞并抑制癌基因的表達是RNAi技術(shù)治療膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵。脂質(zhì)體作為一種細胞組成成分能通過內(nèi)吞作用進入細胞，同時也能有效保護質(zhì)粒不被降解而成為一種理想的基因載體[7]。但傳統(tǒng)脂質(zhì)體由于粒徑大、攜帶負電荷及缺乏識別BBB的特異蛋白等原因，不能透過BBB將基因遞送至CNS內(nèi)，其在膠質(zhì)瘤治療中的使用也受到限制。

NGR是一種由天冬酰胺、甘氨酸、精氨酸人工合成的三肽（Asn-Gly-Arg），其靶向配體為表達于細胞表面的CD13。CD13是一種膜結(jié)合的金屬肽酶，是新血管生成的重要調(diào)節(jié)因子。在膠質(zhì)瘤細胞及新生血管內(nèi)皮細胞上CD13的表達較正常細胞及組織明顯增高，且這種高表達的CD13受體能夠特異性識別NGR，而表達于正常細胞和組織中的CD13沒有該功能[8]。我們擬通過碳二亞胺法將NGR連接到脂質(zhì)體上，利用NGR與CD13的結(jié)合促進脂質(zhì)體跨過BBB或血瘤屏障（blood tumor barrier, BTB），從而使其攜帶的shRNA進入靶細胞中。Birc5作為凋亡抑制因子中的一員，具有抑制凋亡、促進血管生成以及與化療藥物耐藥相關(guān)等作用[9]。Birc5只在惡性腫瘤中表達而不表達于正常組織的特性使其成為絕佳的靶向基因[10]。所以，我們擬構(gòu)建一個含有Birc5 shRNA（shBirc5）的質(zhì)粒，使用lipo-NGR將其遞送至靶細胞內(nèi)發(fā)揮RNAi效應(yīng)，以達到治療腫瘤的目的，從而為膠質(zhì)瘤提供一種新的治療方式。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙胺-羥基聚合物（DSPEPEG2K-COOH）、3β-[N-（N’, N’-二甲基胺乙基）甲?；鵠 膽固醇（DC-chol）、1-（3-二甲氨基丙基）-3乙基碳二亞胺鹽（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸多肽（NGR），均購自美國Avanti公司。高純度質(zhì)粒大提試劑盒質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo被用來構(gòu)建Birc5的shRNA，購自廣州銳博生物技術(shù)公司。FA2004電子天平（上海精密儀器科學(xué)有限公司），VCX-130型聲振儀（美國Sonic公司），激光粒度分析儀（Zetasizer Nano ZS90），RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化器械公司），脂質(zhì)體擠出儀（美國Avanti公司）。shBric5-F序列為5'-GATCCCGCCGGATGACAACCCTATA G T T G A T A T C C G C-T A T A GGGTTGTCATCCGGTTTTTT-3'，shBirc5-R序列為5'-AGCTTTTGGAAAAAAACCGGATGA CAACCCTATAGCGGATATCAACTATAGGGT TGTCATCCGGCGG-3'，未添加shRNA序列的pRNAT-U6.1/Neo作為對照shControl。

1.2 微球的制備

使用電子天平精確稱取DPPC、DSPEPEG2K-COOH、DC-chol分別為5、2、1 mg于圓底燒瓶中。向圓底燒瓶中加入40 ml CDl3溶解混勻各脂質(zhì)體，將燒瓶安裝至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，50℃水浴5 min，持續(xù)水浴并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)40 min成膜。成膜成功后，向燒瓶中加入50℃水浴30 min的PBS緩沖液2 ml，使用聲振儀振蕩2 min。將所得到的脂質(zhì)體混懸液依次通過擠出儀上孔徑為800、400、200和100 nm的濾過膜即得到含有PBS的脂質(zhì)體微球（lipo）[11]。

1.3 NGR靶向載shBirc5脂質(zhì)體的制備

將上述制備的lipo用低溫離心機10 000 r/min離心8 min，使用pH=6.0的MES緩沖液重懸lipo，按摩爾比COOH:EDC:NHS=1:10:30向混懸液中加入NGR溶液（1 mg/ml）。將混懸液冰浴置于振蕩儀上80 r/min振蕩6 h，10 000 r/min離心8 min，重復(fù)3次后即得到lipo-NGR。向lipo-NGR中加入1.8 mg量shBirc5，利用正負電荷的吸引力使lipo-NGR與shBirc5連接，10 000 r/min離心5 min后即得到shBirc5-lipo-NGR[12]。光學(xué)顯微鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)，激光粒度分析儀測定各脂質(zhì)體的粒徑及電位。

1.4 建立SD大鼠原位C6細胞腫瘤模型

細胞的準備：取對數(shù)生長期的C6細胞，制成濃度為1×108/ml的細胞懸液，冰浴備用。常規(guī)術(shù)前準備、麻醉、備皮、固定及消毒。在頭皮正中沿身體長軸切開長約5 mm的切口，找到前囟點，于bregma點右側(cè)3 mm、前方1 mm處，使用電動磨鉆鉆一小孔，微量注射器吸取C6細胞懸液10 μl，并固定到立體定向儀上，針尖對準顱骨上的小孔并與硬腦膜接觸。扭動定向儀上的旋鈕緩慢進針，控制速度為1 mm/min，進針5.5 mm后停留1 min，再向后退1 mm，緩慢將微量注射器內(nèi)的C6細胞注入SD大鼠腦組織中，速度約為1 μl/min，推注完畢后留針10 min。緩慢退針（1 mm/min），骨蠟涂抹顱骨進針小孔后全層縫合手術(shù)切口。在種瘤后7、22天時行MRI T2加權(quán)像檢查腫瘤的形成情況（層厚0.8 mm），選取成瘤佳的大鼠進行后續(xù)實驗。

1.5 實驗分組及觀察

將28只成瘤大鼠隨機分成4組。第1組（對照組）：尾靜脈注射2 ml 0.9%氯化鈉溶液；第2組（shBirc5-lipo組）：經(jīng)尾靜脈注入2 ml shBirc5-lipo；第3組（shControl-lipo-NGR組）：經(jīng)尾靜脈注入2 ml shControl-lipo-NGR；第4組（shBirc5-lipo-NGR組）：經(jīng)尾靜脈注射2 ml shBirc5-lipo-NGR。每組隨機抽取2只大鼠，處理后第10天，2 ml的1%戊巴比妥處死所有SD大鼠，灌洗后取出腦組織，切片后使用免疫組織化學(xué)法觀察腫瘤細胞Birc5蛋白表達情況。剩下的20只大鼠每隔5天行MRI T2加權(quán)像檢測，并按公式V腫瘤=[長（最大層面）×寬（最大層面]）×層數(shù)×0.8/2計算腫瘤大小。按公式V=V目前/V第7天得到腫瘤的生長速度。觀察大鼠的生存時間，在大鼠出現(xiàn)意識障礙、不能進食時用2 ml 1%戊巴比妥處死大鼠，記錄當(dāng)天為大鼠經(jīng)治療后的生存時間。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shBirc5-lipo-NGR的制備及檢測

制得的lipo濃度為（5.02±0.23）×1011/ml，為粒徑均一的圓球形，見圖1，其粒徑和電位分別為（158.6±46.2）nm和（25.5±4.38）mV。lipo-NGR的平均粒徑為（165.6±46.59）nm，較lipo有所增加，但兩者間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.901），lipo-NGR的表面電位為（28.9±4.68）mV，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.04）。說明NGR對lipo的粒徑影響小，而對其電位有明顯的增加作用。制得的lipo-NGR與過量的shBirc5充分反應(yīng)后，測得的粒徑為（186.2±74.07）nm，電位為（10.9±3.76）mV，見圖2。

2.2 原位膠質(zhì)瘤模型的建立

圖1 白光下顯微鏡顯示shBirc5-lipo-NGR的形態(tài)和大小Figure1 Shape and size of shBirc5-lipo-NGR observed by bright-f i eld microscopy

圖2 Zetasizer Nano ZS90測量lipo、lipo-NGR和shBirc5-lipo-NGR的粒徑和電位Figure2 Zeta potential and particle size of lipo, lipo-NGR and shBirc5-lipo-NGR measured by Zetasizer Nano ZS90

通過MRI T2加權(quán)像顯像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)腫瘤在成瘤后第7天時生長于大鼠右側(cè)大腦的基底節(jié)區(qū)，平均大小為（12.21±2.42）mm3，見圖3A。而成瘤后第22天，腫瘤幾乎占據(jù)了大鼠的整個右側(cè)大腦，正常的腦組織受壓嚴重，甚至對側(cè)腦組織也有輕微受壓偏移。其平均腫瘤大小為（273.42±36.37）mm3，證明SD大鼠原位C6細胞腫瘤模型構(gòu)建成功，見圖3B。

圖3 MRI T2像顯示種植C6細胞后原位腫瘤在第7天(A)和第22天(B)時的形成情況Figure3 Orthotopic tumor formation at 7(A) and 22 days(B) after implantation of C6 cells illustrated by T2-weighted MRI

2.3 shBirc5-lipo-NGR的靶向性

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，shBirc5-lipo-NGR組Birc5蛋白較對照、shBirc5-lipo、shControl-lipo-NGR組明顯減少。說明shBirc5-lipo-NGR在大鼠體內(nèi)能跨過BBB或者血瘤屏障（blood tumor barrier,BTB）進入膠質(zhì)瘤細胞，并使其攜帶的shBirc5產(chǎn)生RNAi效應(yīng)，進而抑制Birc5蛋白的表達，而shBirc5-lipo、shControl-lipo-NGR與Control組比較，Birc5無明顯減少，證實了NGR對新生血管內(nèi)皮細胞和膠質(zhì)瘤細胞的靶向性，并且能對Birc5蛋白的表達發(fā)揮RNAi效應(yīng)，見圖4。

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測各組Birc5蛋白表達情況Figure4 Expression of Birc5 protein in each group showed by immunohistochemistry

2.4 shBirc5-lipo-NGR的體內(nèi)效應(yīng)

在成瘤后的第12、17和22天時，對照組腫瘤的平均體積是shBirc5-lipo-NGR組的4.7倍左右，說明shBirc5-lipo-NGR能夠抑制腫瘤的生長（P＜0.001)。而對照組分別與shBirc5-lipo和shControl-lipo-NGR組中腫瘤體積對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.459, P=0.468），見圖5、圖6A。對比腫瘤生長的速度也得出了相似的結(jié)果，見圖6B。對照、shBirc5-lipo、shControl-lipo-NGR和shBirc5-lipo-NGR組的中位生存期分別為21、22、24和30天，見圖7。分別與對照、shBirc5-lipo和shControl-lipo-NGR組比較，shBirc5-lipo-NGR組的中位生存時間明顯延長，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.010、0.010、0.005），證實了shBirc5-lipo-NGR能延長SD大鼠原位C6膠質(zhì)瘤生存期，且這種抑制作用是通過shBirc5介導(dǎo)的。

3 討論

RNAi技術(shù)因其能特異性的沉默靶基因mRNA抑制其蛋白的表達而成為近年基因編輯的研究熱點，其高度的特異性和安全性有望成為根治腫瘤的有效方式。RNAi技術(shù)主要包括siRNA、shRNA、dsRNA等幾種形式，相比于其他形式，shRNA具有性質(zhì)穩(wěn)定、能自我復(fù)制、抑制率高等特點而被廣泛使用[13]。

圖5 MRI T2相監(jiān)測大鼠植入C6細胞后腫瘤在7、12、17和22天時的生長情況Figure5 Tumors growth at 7, 12, 17 and 22 days after C6 cells implantation longitudinally monitored by T2-weighted MRI

在CNS疾病中，藥物或基因能夠透過BBB是其對疾病達到治療目的的前提，藥物或基因?qū)BB的通透性是由它的粒徑、電位、脂溶性及是否有受體介導(dǎo)決定的[14]。如何實現(xiàn)靶基因shRNA跨過BBB轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞并抑制癌基因的表達是RNAi技術(shù)治療膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵。本實驗最終制得的shBirc5-lipo-NGR，其粒徑為（186.2±74.07） nm，為基因載體在腫瘤部位產(chǎn)生保留（enhanced permeability and retention, EPR）效應(yīng)[15]提供條件。為了提高轉(zhuǎn)染效率，用于基因轉(zhuǎn)染的納米粒帶少量正電荷或者不帶電荷[16]。本實驗中制得的lipo-NGR經(jīng)激光粒度分析儀測得的電位為（28.9±4.68）mV，在與shBirc5充分結(jié)合后其電位降為（10.9±3.76）mV，利用電荷吸引能很好地與血管內(nèi)皮細胞及膠質(zhì)瘤細胞結(jié)合，并為最終由NGR-CD13介導(dǎo)shBirc5-lipo-NGR跨過BBB或者BTB提供條件[17]。

NGR作為靶向因子，能特異性識別高表達CD13的新生血管內(nèi)皮細胞和膠質(zhì)瘤細胞，通過其與靶蛋白CD13結(jié)合介導(dǎo)靶細胞對shBirc5-lipo-NGR的內(nèi)吞作用，進而發(fā)揮RNAi效應(yīng)，同時達到了跨BBB和BTB的目的，為治療SD大鼠原位膠質(zhì)瘤提供條件[18]。

圖6 基于MRI T2相分析腫瘤大小(A)和生長速率(B)Figure6 Tumor volume(A) and its increase rate(B)analyzed by longitudinal T2-weighted MRI

圖7 不同處理組荷瘤大鼠生存曲線Figure7 Survival curves (Kaplan-Meier plot) of gliomabearing rats in different groups

在體內(nèi)實驗中，為了證實shBirc5-lipo-NGR能對膠質(zhì)瘤發(fā)揮治療作用，我們使用MRI T2動態(tài)監(jiān)測腫瘤的大小，并同時記錄了每只SD大鼠的生存時長。結(jié)果顯示shBirc5-lipo-NGR能明顯抑制腫瘤的生長和延長荷瘤大鼠的生存時長。而使用shBirc5-lipo或shControl-lipo-NGR均未對腫瘤的生長和生存期發(fā)揮明顯作用。相較于使用微泡開放BBB后應(yīng)用載體向膠質(zhì)瘤細胞遞送基因，shBirc5-lipo-NGR具有以下優(yōu)點：（1）更簡潔的操作流程：使用shBirc5-lipo-NGR只需注射一次藥物，而使用微泡需至少注射兩次，并且需借助超聲來開放BBB；（2）更高的安全性：在超聲聯(lián)合微泡開放BBB的過程中，微泡量過多或者超聲強度過大，極易引起腦出血、肺栓塞等致死性并發(fā)癥，而使用大量shBirc5-lipo-NGR也不會出現(xiàn)這類并發(fā)癥。本研究中也存在一些不足，使用本新型靶向shBirc5脂質(zhì)載體并未達到治愈腫瘤的目的，這可能是因為膠質(zhì)瘤細胞及新生血管內(nèi)皮細胞上CD13受體量有限，相應(yīng)地限制了由其介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞作用，從而使RNAi效應(yīng)發(fā)揮不完全。這是由細胞本身的特性決定的。另一方面，由于基因的異質(zhì)性，Birc5蛋白在腫瘤的生長過程中發(fā)揮的作用有限，還有許多其他的蛋白（比如TEM7、S100 A8和S100 A9蛋白等）具有促進腫瘤生長的作用[19-20]。這種不足可以通過使用幾種在膠質(zhì)瘤生長過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白shRNA來加以克服[21]。

在本研究中，我們成功制備了靶向載shBirc5脂質(zhì)微球shBirc5-lipo-NGR，并將其應(yīng)用于SD大鼠原位膠質(zhì)瘤模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、MRI T2顯像等技術(shù)及手段證實了shBirc5-lipo-NGR對膠質(zhì)瘤的靶向性及抑制作用。靶向載基因脂質(zhì)微球因其能跨過BBB/BTB，有望作為膠質(zhì)瘤治療的一種新方法，但要將其成功應(yīng)用于臨床仍有大量工作需要完成。