楊益廣 黃作喜

摘要：蛹蟲草作為冬蟲夏草替代品，在傳統(tǒng)中藥上具有重要的藥用價(jià)值。近年來(lái)，由于過(guò)度采挖，導(dǎo)致野生冬蟲夏草資源越來(lái)越少，而蛹蟲草的人工培養(yǎng)已初具規(guī)模。該文綜述了蛹蟲草的菌種選育、人工培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基制作、接種技術(shù)、培養(yǎng)環(huán)境調(diào)控、子實(shí)體采收、次級(jí)代謝產(chǎn)物提取等環(huán)節(jié)技術(shù)的研究進(jìn)度，并提出了蛹蟲草人工培養(yǎng)的發(fā)展方向，即：以液體發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、降低污染率，以及提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的利用率為重點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草;人工培養(yǎng);研究進(jìn)展

蟲草類藥材在中藥上具有極高的藥用價(jià)值，其中冬蟲夏草的市場(chǎng)價(jià)值最高。近年來(lái)，由于人們對(duì)冬蟲夏草的過(guò)度采挖，使其野生資源日漸稀少，市場(chǎng)需求遠(yuǎn)大于自然生產(chǎn)量。而蛹蟲草作為冬蟲夏草的替代品，擁有與冬蟲夏草相似的藥用功效，且已實(shí)現(xiàn)人工培養(yǎng)和規(guī)?；a(chǎn)。傅明等以蛹蟲草子實(shí)體為材料，分離純化得到3種物質(zhì)，均具有抗HIV-1蛋白酶活性[1]，且蟲草素、蟲草多糖等物質(zhì)對(duì)于抗腫瘤、抗HIV具有重要藥效，其安全性已被國(guó)家批準(zhǔn)認(rèn)可。在人工培養(yǎng)條件下，蛹蟲草的蟲草素、碳氮化合物的含量等不低于甚至高于冬蟲夏草。江曉路等研究認(rèn)為人工栽培蛹蟲草的SOD活性更高[2]。

目前，蛹蟲草的培養(yǎng)方式主要有活體人工培養(yǎng)、人工固體培養(yǎng)基培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)3種，技術(shù)成熟、推廣應(yīng)用廣泛，開辟了蛹蟲草新的藥材資源。本文通過(guò)對(duì)蛹蟲草的菌種培育、人工培養(yǎng)系列技術(shù)及未來(lái)研究開發(fā)重點(diǎn)等的探討，為蛹蟲草的大規(guī)模人工培養(yǎng)提供理論與技術(shù)參考。

1 菌種選育

1.1 菌種選育方法 菌種選育是蛹蟲草人工培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一。優(yōu)良菌種的子實(shí)體產(chǎn)量，菌種的傳代次數(shù)，子實(shí)體的萌發(fā)幾率以及蟲草素的含量等，都高于劣質(zhì)種源的。大部分蛹蟲草在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中都會(huì)發(fā)生菌種退化現(xiàn)象，即子實(shí)體不萌發(fā)，菌種不進(jìn)行生殖生長(zhǎng)而回退到營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的過(guò)程，其中菌核核型的改變是大部分學(xué)者認(rèn)可的菌種退化的內(nèi)在原因。經(jīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明：蛹蟲草發(fā)生生殖生長(zhǎng)回退到營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的現(xiàn)象，其實(shí)質(zhì)是異核相轉(zhuǎn)變成同核相所致的，異核相具有2個(gè)交配型單孢子，同核相只具備1個(gè)交配型單孢子，而只有同時(shí)擁有2個(gè)交配型單孢子子實(shí)體才能夠正常生長(zhǎng)，當(dāng)蛹蟲草異核相轉(zhuǎn)變?yōu)橥讼嗑蜁?huì)發(fā)生菌種退化現(xiàn)象，子實(shí)體不能生長(zhǎng)。菌種退化也與菌種傳代次數(shù)、菌種選育保存條件等諸多因素有關(guān)。造成菌核核型改變的可能因素有外部環(huán)境、物理因素、化學(xué)誘變、以及遺傳等。因此，對(duì)于菌種的選育，不僅需要考慮環(huán)境、種源等外部因素，更要考慮內(nèi)部遺傳因素的影響。

目前，較為成熟的菌種選育技術(shù)有組織分離、孢子培養(yǎng)以及雜交育種3類。組織分離是選擇優(yōu)良子實(shí)體進(jìn)行懸掛式分離，再接種于PDA培養(yǎng)基鑒別優(yōu)劣，并制作保存菌種的辦法。孢子培養(yǎng)是指從蛹蟲草中分離單個(gè)孢子并培養(yǎng)成成熟菌絲，從而獲得純菌種的方法。雜交育種是指利用蛹蟲草的二極性異宗配合習(xí)性，選取優(yōu)良性狀菌種雜交而獲得性狀優(yōu)良、遺傳穩(wěn)定的菌種選育方法。3種方法各有優(yōu)劣，但以組織分離法最為簡(jiǎn)單有效、成本低，生產(chǎn)上大都選用此法。王艷華等通過(guò)對(duì)尖頭及圓頭蛹蟲草組織分離和孢子分離選育研究發(fā)現(xiàn)，截取上部1.5cm以內(nèi)的組織塊分離出的菌種相對(duì)能保證轉(zhuǎn)色出草，越靠近下部的出草率越低或不出草[3]。

1.2 表型性狀選育菌種技術(shù) 良好的表現(xiàn)型性狀是菌種選育的目標(biāo)。袁雪芬從人工栽培的蛹蟲草子實(shí)體分離得到Az和Bz 2個(gè)群體菌株，觀察其菌落形態(tài)并從中選取部分菌株進(jìn)行子實(shí)體產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，菌落顏色為杏橙色且氣生菌絲較少的菌株經(jīng)搖培后的菌絲球較小，而且密集，出草率高且產(chǎn)量高[4]。李光榮等通過(guò)對(duì)野生蛹蟲草單孢子進(jìn)行分離并進(jìn)行生產(chǎn)子實(shí)體試驗(yàn)，觀察與測(cè)定子實(shí)體所含蟲草素含量，發(fā)現(xiàn)菌落背面顏色呈橙鉻色的菌株容易產(chǎn)生子實(shí)體[5]。結(jié)合上面的方法，可以通過(guò)以下2個(gè)階段試驗(yàn)選育優(yōu)良菌種：第1階段，固體培養(yǎng)選擇菌落顏色深、氣生菌絲少的菌種進(jìn)入第2階段液體搖培篩選;第2階段，通過(guò)液體揺培，觀察菌絲球形態(tài)，選擇菌絲球細(xì)小、密集的菌種用作生產(chǎn)種。同時(shí)要注意，菌落顏色呈橙色的菌株容易產(chǎn)生子實(shí)體、產(chǎn)量較高。

2 蛹蟲草人工培養(yǎng)技術(shù)

2.1 人工培養(yǎng)方式 自1987年梁曼逸等率先以家蠶和柞蠶為寄主培養(yǎng)蛹蟲草，獲得了與天然蛹蟲草相似的子實(shí)體[6]，隨后柞座蛹、蠶蛹等蛹蟲草的人工培養(yǎng)相繼成功，至今已出現(xiàn)了3種主要的培養(yǎng)方式：蠶蛹接種培養(yǎng)、人工固體培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)。3種培養(yǎng)方式所需原料和成本都不一樣，產(chǎn)出產(chǎn)物、效率、品質(zhì)的差異也十分巨大。蠶蛹接種培養(yǎng)是一種以活的蠶蛹為寄主，將蟲草菌種注入寄主體內(nèi)，給予蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)適宜的環(huán)境條件，最終得到產(chǎn)物，所涉及的蠶蛹選擇培育、菌種的保存培養(yǎng)等技術(shù)都是極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。該方法存在許多不足與限制，如蠶蛹生長(zhǎng)具有季節(jié)性，不適宜連續(xù)生產(chǎn)蛹蟲草，注射菌液易污染，成本高、效率低，所得產(chǎn)物量不受控制等?；诖?，蛹蟲草人工固體培養(yǎng)基培養(yǎng)則克服了以上的缺點(diǎn)，該方法通過(guò)添加營(yíng)養(yǎng)成分，配制蛹蟲草所需營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基替代蠶蛹，將蟲草菌接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，國(guó)內(nèi)常用大米、小麥等固體培養(yǎng)基，取得了較好的效果而被廣大生產(chǎn)者所接受。液體發(fā)酵培養(yǎng)是蛹蟲草人工培養(yǎng)領(lǐng)域內(nèi)擁有廣闊前景的培養(yǎng)方式，其菌絲產(chǎn)量高、生長(zhǎng)速度快、可連續(xù)生產(chǎn)，營(yíng)養(yǎng)成分及所需產(chǎn)物量都能通過(guò)營(yíng)養(yǎng)元素配比達(dá)到合理控制。

蛹蟲草培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素配比、空氣濕度、光照等條件的要求較為苛刻，蠶蛹接種培養(yǎng)以及人工固體培養(yǎng)受制于培養(yǎng)條件都難以實(shí)現(xiàn)機(jī)械化操作和規(guī)模培養(yǎng)，成本較高、易受環(huán)境影響，相比之下液體發(fā)酵培養(yǎng)更適合機(jī)械操作，受環(huán)境影響較小，生產(chǎn)條件安全可控，更適合實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，不同培養(yǎng)方式的操作流程差異也較大。

蛹蟲草人工培養(yǎng)的基本操作流程如下：蠶蛹接種培養(yǎng)，菌種選育→蠶蛹選取→接種培養(yǎng);人工固體培養(yǎng)，野生或培育種源選取→菌種分離、選育、復(fù)壯→試管母種→菌種擴(kuò)繁→培養(yǎng)基制作滅菌→裝瓶（盆或袋）→接種→環(huán)境控制→采收;液體發(fā)酵培養(yǎng)，制作菌種斜面→搖瓶菌種培養(yǎng)→種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)→液體發(fā)酵罐深層發(fā)酵→離心分離。

2.2 不同培養(yǎng)方式的培養(yǎng)基制作 按照培養(yǎng)方式不同，可將培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基2種。在人工控制的環(huán)境條件下，不同培養(yǎng)基成分對(duì)蛹蟲草的培養(yǎng)起著至關(guān)重要的作用。

2.2.1 固體培養(yǎng)基 我國(guó)生產(chǎn)者大都選用大米、小麥做原料制作固體培養(yǎng)基，原料簡(jiǎn)便易得、成本低，培養(yǎng)出來(lái)的蛹蟲草品質(zhì)好、蟲草素含量高。固體培養(yǎng)基的元素搭配有很多不同的配比，通過(guò)不同原料配比所得到的蟲草營(yíng)養(yǎng)素含量與品質(zhì)也大不相同。

張志瑾等以菌種初萌發(fā)時(shí)間、菌絲長(zhǎng)速、菌絲長(zhǎng)勢(shì)、菌絲長(zhǎng)滿斜面所需時(shí)間為指標(biāo)，篩選出最佳母種培養(yǎng)基配方為：20%馬鈴薯提取液中加入1%葡萄糖、1%蛋白胨、2%瓊脂、0.5%KH2PO4、0.3%MgSO4、10mg/L VB1，pH值5.8[7]。李春斌等通過(guò)對(duì)蛹蟲草子實(shí)體的人工培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，固體營(yíng)養(yǎng)物以小米和高粱米的混合物為最佳，最佳碳、氮源為可溶性淀粉和蛋白胨，最佳pH范圍是5～6，VB1、2，4-D和無(wú)機(jī)元素K+、Mg2+、Ca2+對(duì)子實(shí)體的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[8]。高倩倩等以蟲草子座干重為研究指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草工廠化生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)基配方為90%小麥、10%豆粕，營(yíng)養(yǎng)液為15g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、1g/L KH2PO4、1g/L MgSO4·7H2O、1g/L VB1、1g/L檸檬酸銨，合適的料液比為1.0∶1.6[9]。

2.2.2 液體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基以各種不同的營(yíng)養(yǎng)成分搭配，操作更安全可控、空間利用大、生產(chǎn)周期短、效益更高。韋會(huì)平等通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，液體菌種栽培比常規(guī)栽培發(fā)菌時(shí)間縮短10d，現(xiàn)蕾出草時(shí)間縮短15d左右，且出草整齊，普遍能出2茬子實(shí)體，常規(guī)栽培的出草往往不整齊，用液體菌種栽培的產(chǎn)量及生物轉(zhuǎn)化率是常規(guī)栽培的4倍多，差異極為顯著[10]?，F(xiàn)多采用液體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，所得產(chǎn)物的蟲草素更易提取，省去子實(shí)體提取工序。萬(wàn)琴等以蟲草素含量為研究指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)最佳配方為：23g/L葡萄糖、6g/L酵母浸出粉、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.6g/L KH2PO4、0.01g/L VB1[11]。陳晉安等以菌絲體生長(zhǎng)為研究指標(biāo)，得出最適蛹蟲草發(fā)酵的液體培養(yǎng)基組分為：50g/L蔗糖、30g/L玉米漿、5g/L酵母膏、0.5g/L MgSO4·7H2 O、0.5g/L KH2PO4[12]。牛帥科等以菌體干重為研究指標(biāo)，研究認(rèn)為適合蛹蟲草菌的液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基為：53.36g/L葡萄糖、26.72g/L蛋白胨、20g/L MgSO4·7H2O、0.5g/L KH2PO4[13]。范志微以菌絲體生長(zhǎng)速度、菌絲體干重和菌落大小為指標(biāo)進(jìn)行初篩，以子實(shí)體干重、培養(yǎng)周期以及子實(shí)體形態(tài)、粗多糖含量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)水平組合為：3g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，2g/L MgSO4·7H2O1.5g/LKH2PO4[14]。以上實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)應(yīng)不同的生產(chǎn)指標(biāo)要求，蛹蟲草液體培養(yǎng)基的成分和含量的差異較大。

2.3 不同培養(yǎng)方式的接種技術(shù) 接種是蛹蟲草人工培養(yǎng)重要的技術(shù)環(huán)節(jié)之一，由于需要在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，操作必須規(guī)范嚴(yán)謹(jǐn)。

2.3.1 蛹蟲草活體 蛹蟲草活體接種的方式多種多樣，安秀榮等比較研究了以下方法：（1）對(duì)活體蟲蛹進(jìn)行液體菌種注射;（2）先將活體蛹扎孔放人廣口瓶，再倒入10mL液體菌種;（3）倒入10mL液體菌種至廣口瓶，再將活體蛹直接放入;（4）將已經(jīng)培養(yǎng)成熟的子座接入活體蛹的體腔內(nèi);（5）將活體蛹扎孔后放人子座已長(zhǎng)好的培養(yǎng)基上，使其自然感菌;（6）將活體蛹扎孔后放入已發(fā)滿菌絲的培養(yǎng)基上;（7）將斜面菌種接入活體蟲蛹體腔內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌液注射0.2～0.5mL入活體蛹的體腔內(nèi)，出草較多，因菌絲侵入蟲體內(nèi)部，利用蟲體內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)，所形成的子實(shí)體健壯，商品率高。所以在生產(chǎn)中采用活體注射入體腔的方式最好[15]。

2.3.2 蛹蟲草人工固體培養(yǎng) 接種過(guò)程必須保證無(wú)雜菌污染，接種時(shí)根據(jù)環(huán)境條件和設(shè)施，選擇適宜的無(wú)菌接種方式。將注射器等接種器具放入沸水或高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20～30min，培養(yǎng)基提前進(jìn)行高壓滅菌，溫度達(dá)124℃時(shí)保持1.5h左右，滅菌結(jié)束后鍋內(nèi)，待溫度達(dá)60℃左右時(shí)取出培養(yǎng)基，冷卻凝固后接種。嚴(yán)格按照無(wú)菌接種操作將菌種用無(wú)菌水稀釋倒入無(wú)菌瓶，在超凈工作臺(tái)上用注射器吸取菌液，在酒精火焰燈附近戳破無(wú)菌膜接種在固體培養(yǎng)基上。晃動(dòng)固體培養(yǎng)基，使菌液均勻遍布培養(yǎng)基表面，接入菌量不宜過(guò)少，放置于培養(yǎng)架上進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3.3 蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng) 提前將蛹蟲草菌接種于改良PDA培養(yǎng)基，在（21±1）℃光照環(huán)境下活化培養(yǎng)，待菌株蔓延至培養(yǎng)基邊緣時(shí)，保存于冰箱備用。在無(wú)菌接種間，于超凈工作臺(tái)上將活化的菌絲接種于已滅菌的改良PDA液體培養(yǎng)基，放于搖柜170r/min、（21±1）℃搖培4～5d，獲得少量種菌懸液，然后接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量在10%～15%，注入發(fā)酵罐進(jìn)行分批發(fā)酵，罐壓0.05～0.07MPa，通風(fēng)量為1∶0.05（V/V·min），攪拌速率200r/min較為適宜。

2.4 子實(shí)體培養(yǎng)及環(huán)境調(diào)控 子實(shí)體由蛹蟲草真菌生殖菌絲生長(zhǎng)而成，頂端膨大呈棒狀，是蛹蟲草人工培養(yǎng)的最終產(chǎn)物，一般子實(shí)體生長(zhǎng)至橘紅色便代表已經(jīng)成熟可以采收。影響子實(shí)體生長(zhǎng)的因素包括溫度、光照、濕度、晝夜溫差、空氣成分、碳氮比等。生產(chǎn)上一般將栽培瓶放置在培養(yǎng)架上培養(yǎng)，溫度控制在22～25℃避光培養(yǎng)。菌絲長(zhǎng)滿瓶進(jìn)入原基形成階段，此階段每天要保持12h左右光照，若光線不足可用日光燈替代，空氣濕度保持在65%～70%、溫度18～22℃、晝夜溫差3～5℃、光照強(qiáng)度100lx左右適宜原基分化，大約5d左右菌絲由白色轉(zhuǎn)變?yōu)殚冱S色形成子實(shí)體，原基分化完成后子實(shí)體已成型進(jìn)入子實(shí)體培養(yǎng)階段。蛹蟲草屬于低溫菌類，子實(shí)體與子座對(duì)生長(zhǎng)溫度有著很高的敏感度，光照對(duì)人工培養(yǎng)子實(shí)體有效成分蟲草素、蟲草多糖等的合成具有重要影響，子座最適宜生長(zhǎng)溫度為18～22℃，如果低于或高于這個(gè)溫度范圍，生長(zhǎng)減慢，高于30℃會(huì)很快死亡，子實(shí)體生長(zhǎng)適宜溫度為18～22℃，超過(guò)25℃則難以形成。王菊風(fēng)認(rèn)為，蛹蟲草生長(zhǎng)發(fā)育的適宜溫度是17～25℃，子實(shí)體生長(zhǎng)的最適溫度是22℃[16]，強(qiáng)光有利于蟲草多糖、胡蘿卜素等的提高，弱光有利于子實(shí)體產(chǎn)量、蟲草素等的提高，延長(zhǎng)光照時(shí)間則有利于原基形成。子實(shí)體培養(yǎng)期間應(yīng)將光照時(shí)間縮短至自然長(zhǎng)度，保證白天有充足的散射光，晚上不補(bǔ)光，每天轉(zhuǎn)動(dòng)不同瓶面以確保子實(shí)體受光均勻，大約15d即可采收第一批子實(shí)體。張金艷經(jīng)過(guò)綜合研究認(rèn)為，蛹蟲草培養(yǎng)適宜的光照條件為：白熾光、光照強(qiáng)度為200lx，每天光照時(shí)間分階段設(shè)置，原基形成階段24h/d、子實(shí)體生長(zhǎng)階段16 h/d為最佳[17]。高曉梅等通過(guò)光質(zhì)和光強(qiáng)對(duì)蛹蟲草子實(shí)體形成、生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)認(rèn)為光強(qiáng)：50～100lx弱光對(duì)原基分化、子實(shí)體誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，1000lx條件下子實(shí)體生長(zhǎng)較好，橙黃光條件下子實(shí)體的質(zhì)量和產(chǎn)量都有所提高[18]。綜上所述認(rèn)為，子實(shí)體培養(yǎng)過(guò)程中的光照、溫度、空氣濕度是重點(diǎn)控制的3個(gè)要素，溫度保持在22℃左右、光照強(qiáng)度1000 lx左右、空氣濕度在65%～70%，適宜于蛹蟲草子實(shí)體的培養(yǎng)。

2.5 子實(shí)體采收及次級(jí)代謝產(chǎn)物蟲草素等的提取

2.5.1 子實(shí)體采收 在經(jīng)過(guò)嚴(yán)格控制的環(huán)境條件下培養(yǎng)15d左右，子實(shí)體表面長(zhǎng)度達(dá)到6～7cm，子囊膨大成熟，便可以采收第1批子實(shí)體。用工具小心將子實(shí)體基部采下，除去表面雜質(zhì)和多余的水分。繼續(xù)培養(yǎng)一個(gè)周期可以收獲第2批子實(shí)體。將所采收的子實(shí)體用40～45℃烘干器烘干至含水量≤12%，分批保存。人工培養(yǎng)的蛹蟲草包含蟲草素、蟲草多糖等多種稀有營(yíng)養(yǎng)元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，若將其中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提取出來(lái)并作藥用，或加工或開發(fā)保健品，將大幅度提高其附加值。

2.5.2 次級(jí)代謝產(chǎn)物蟲草素等的提取 雖然從子實(shí)體中提取所得蟲草素含量最多，但在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，為使經(jīng)濟(jì)效益最大化，蛹蟲草的培養(yǎng)基殘?jiān)械南x草素、蟲草多糖等有較大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物也不容忽視，并且從副產(chǎn)物中提取也比從子實(shí)體中提取的成本更低、效益更高。因此，研究如何從培養(yǎng)基殘?jiān)刑崛∠x草素等成為了行業(yè)研究的熱點(diǎn)。韋會(huì)平等通過(guò)連續(xù)逆流提取、732陽(yáng)離子交換樹脂柱層析和結(jié)晶3步法，對(duì)每一步的工藝參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，用該優(yōu)化的方法從大米培養(yǎng)基中提取蟲草素，產(chǎn)品的純度達(dá)98.0%以上，產(chǎn)率達(dá)66.0%以上[19]。車振明通過(guò)對(duì)蛹蟲草子實(shí)體及培養(yǎng)基的粉碎，采用石油醚脫脂、80～85℃水浴12h、調(diào)節(jié)等電點(diǎn)沉淀、732-NH4離子交換樹脂的分離和濃縮、4℃下低溫結(jié)晶方法，得到純度達(dá)81%的蟲草素晶體[20]。孫詩(shī)清從優(yōu)化的蟲草素和蟲草多糖生產(chǎn)工藝出發(fā)，研究出同時(shí)提取蟲草素和蟲草多糖的工藝方法，同時(shí)，分別采用高效液相和苯酚-硫酸法對(duì)蟲草素和蟲草多糖進(jìn)行含量測(cè)定，確定不同純化方法所得蟲草素蟲草多糖的含量差異，進(jìn)一步確定分別使用陰離子樹脂和DEAE纖維素為最好的純化方法[21]。麻兵繼等用石油醚脫脂，殘?jiān)稍锖笠詿嵋掖继崛〉媒?，浸膏轉(zhuǎn)水溶后調(diào)節(jié)等電點(diǎn)，再用活性炭脫色，脫色后的溶液最后過(guò)732陽(yáng)離子交換樹脂以NH3·H2O洗脫液洗脫，得到蟲草素純度約為80%，總得率約為1‰[22]。綜合上述研究，我們可以得出其基本的分離提取步驟：先用石油醚脫脂，再用離子交換樹脂進(jìn)行初步分離，由于蟲草素呈弱堿性，所以應(yīng)該選用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂進(jìn)行分離，最后經(jīng)過(guò)濃縮，在低溫下結(jié)晶，便可得到純度較高的蟲草素結(jié)晶產(chǎn)物。

3 展望

目前，蛹蟲草人工培養(yǎng)雖能規(guī)?；a(chǎn)，但仍存在一些問(wèn)題，如菌種退化、次級(jí)代謝產(chǎn)物（殘留蟲草素培養(yǎng)基）利用率低等。（1）蛹蟲草人工培養(yǎng)普遍存在菌種退化的問(wèn)題，即培養(yǎng)一定周期后蛹蟲草菌子實(shí)體不再生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)不全。菌種退化最容易出現(xiàn)在大規(guī)模培養(yǎng)基固體培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)等批次培養(yǎng)過(guò)程中。夏鳳娜等研究了蛹蟲草在5種保藏條件下菌絲活化的情況以及菌絲活化后的深層培養(yǎng)和固體培養(yǎng)長(zhǎng)勢(shì)等發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草最佳保藏溫度為（4±2）℃[23]，溫度可以影響菌種退化率，汪虹等對(duì)收集到的14株蛹蟲草正常菌株和退化菌種進(jìn)行PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，3株正常菌株為異核體，11株退化菌株僅僅含有MAT-HMG或者M(jìn)AT-alpha交配型基因，判定為同核體[24]，通過(guò)預(yù)防核相改變防止菌種退化是解決問(wèn)題的根本，在實(shí)際生產(chǎn)中可以采用減少傳代次數(shù)，改善培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)配比，優(yōu)化菌種種源的保存環(huán)境、調(diào)節(jié)pH，及時(shí)復(fù)壯選育優(yōu)質(zhì)種源等方式降低菌種退化。（2）我國(guó)蛹蟲草人工固體培養(yǎng)過(guò)程中的殘余物質(zhì)蟲草素等的提取工藝還并不完善，次級(jí)代謝產(chǎn)物利用率極低。因此，未來(lái)需要大力提升蛹蟲草次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取工藝水平、降低提取成本，提高提取效率。

當(dāng)前，我國(guó)的蛹蟲草人工培養(yǎng)仍以固體培養(yǎng)或蠶蛹活體培養(yǎng)為主要方式，然而蠶蛹或固體培養(yǎng)都存在成本高、經(jīng)濟(jì)效益低等問(wèn)題，在培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)無(wú)菌以及生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，需要嚴(yán)格控制空氣溫度和空氣濕度，耗費(fèi)大量的人力物力，蟲草素的提取成本高、效率低?；铙w人工培養(yǎng)一般在春季4—7月培養(yǎng)，受生物蟲體因素影響大。液體發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)快、周期短、條件安全可控，污染較前2種方式更低，可通過(guò)發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵，蟲草素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提取方便，能適應(yīng)工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。因此，未來(lái)蛹蟲草人工培養(yǎng)將以液體發(fā)酵培養(yǎng)為主要發(fā)展方向，逐步實(shí)現(xiàn)蛹蟲草的工業(yè)化、規(guī)范化生產(chǎn)。

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（責(zé)編：張宏民）