滿珈羽 ，焦菲菲 ，王逸雅 ，顧月清 ，舒 暢 **，丁 黎 **中國藥科大學(xué)，南京 0009；南京科利泰醫(yī)藥科技有限公司，南京 00

苯佐那酯軟膠囊具有療效好、不良反應(yīng)低、無成癮性等特點(diǎn)，被美國胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)推薦為治療癌癥病人咳嗽的首選藥物[1-5]。但是該藥目前尚未在中國上市，且國內(nèi)外沒有關(guān)于苯佐那酯藥代動(dòng)力學(xué)研究的報(bào)道，因此了解苯佐那酯軟膠囊中活性成分的濃度在中國健康受試者體內(nèi)的經(jīng)時(shí)變化過程對指導(dǎo)臨床用藥具有重大意義。再者，由于苯佐那酯是一種由15種聚合物單體組成的混合物，與代謝產(chǎn)物4-N-丁基氨基苯甲酸（BBA）間存在確定的量化關(guān)系。故本研究通過兩種HPLC-MS/MS法分別測定了血漿中原始BBA的濃度（方法B）和總BBA的濃度（包含原始BBA的濃度和由苯佐那酯轉(zhuǎn)化的BBA的濃度，方法A），根據(jù)總BBA濃度和原始BBA濃度的差值推算得到了血漿中苯佐那酯的濃度，并將其成功地應(yīng)用于中國健康受試者單次及多次口服苯佐那酯軟膠囊后的藥代動(dòng)力學(xué)研究。由于苯佐那酯會(huì)被基質(zhì)中的酯酶快速水解為BBA，因此將含藥全血樣品在室溫條件下放置2小時(shí)后離心，使苯佐那酯完全轉(zhuǎn)化為BBA，以檢測血漿中總BBA的濃度。為了檢測血漿中原始BBA的濃度，必須抑制苯佐那酯的轉(zhuǎn)化，因此在含藥全血樣品中加入酯酶抑制劑甲硫酸新斯的明[6]?，F(xiàn)將本研究主旨予以報(bào)道。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

苯佐那酯軟膠囊 （規(guī)格：100mg/粒、200mg/粒，批號：LC-B20170503、LC-B20170501， 石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司）；BBA對照品 （純度：99.7%，批號：2420-018A1，TLC）； 內(nèi)標(biāo)替米沙坦 （純度：99.6%，批號：100629-201202，中國食品藥品檢定研究院）；甲硫酸新斯的明對照品 （批號：100550-200401，中國食品藥品檢定研究院）。

甲醇、乙腈（色譜純，Merck KGaA）；甲酸、醋酸銨（ACS，Sigma-Aldrich）；試驗(yàn)用水為超純水（Milli-Q制備）。

1.2 儀器與設(shè)備

島津高效液相色譜儀 （液相泵：LC-20ADXR，柱溫箱：CTO-20AC，控制器：CBM-20A Lite，脫氣機(jī)：DGU-20A5R，自動(dòng)進(jìn)樣器：SIL-30AC）；質(zhì)譜儀（API 4000，Applied Biosystems/Sciex），質(zhì)譜工作站（Analyst 1.6.2，Applied Biosystems/Sciex）；電子天平（Sartorius）；離心機(jī)（Thermo Fisher）等。

2 方 法

2.1 檢測條件

離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；離子極性：正離子；離子檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；碰撞氣壓力（CAD）：7Unit；氣簾氣壓力（CUR）：241.3 kPa；噴霧氣壓力 （GS1）：275.6 kPa；輔助加熱氣壓力（GS2）：275.6 kPa；離子噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550℃。BBA和替米沙坦的離子對分別為m/z194.2→138.1和m/z515.3→497.3。電參數(shù)設(shè)置見表1。

表1 BBA和替米沙坦的電參數(shù)

色譜柱：Agilent Poroshell 120 Phenyl Hexyl（2.1mm×50mm，2.7μm）； 柱溫：40℃； 流動(dòng)相：含0.3%甲酸和5mmol·L-1醋酸銨的水溶液-乙腈 （60∶40）；流速：0.3mL·min-1；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：8 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

方法A：精密稱取適量BBA對照品，用100%甲醇溶解配制成濃度為1.00mg·mL-1的BBA儲備液；用50%甲醇水溶液稀釋儲備液，配制不同濃度的BBA對照品工作溶液。精密稱取內(nèi)標(biāo)替米沙坦適量，用100%甲醇溶解成濃度為1.00mg·mL-1的替米沙坦儲備液；用50%甲醇水溶液稀釋，得到濃度為900ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)替米沙坦工作溶液。

方法B：BBA對照品儲備液、工作溶液及內(nèi)標(biāo)替米沙坦儲備液的配制方式和濃度與 “方法A”一致。用50%甲醇水溶液稀釋內(nèi)標(biāo)替米沙坦儲備液，配制成內(nèi)標(biāo)工作溶液，濃度為 60.0 ng·mL-1。精密稱取適量的甲硫酸新斯的明對照品，用超純水溶解，配制成濃度為10.0mg·mL-1的甲硫酸新斯的明儲備液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制

方法A：在室溫下，按1∶19的比例將BBA的工作溶液與空白血漿混合均勻，配制BBA的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品。其中，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品濃度為10.0、20.0、100、500、2 500、5 000、8 000、10 000 ng·mL-1，低、中、高質(zhì)控樣品的濃度為 25.0、250、7500ng·mL-1。

方法B：在冰浴條件下，按1∶19的比例將BBA的工作溶液與含甲硫酸新斯的明的空白血漿混合均勻，配制BBA的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品，濃度與“方法A”一致。此方法中含甲硫酸新斯的明的空白血漿是由含甲硫酸新斯的明儲備液的空白全血（25∶1000）離心所得。

2.4 樣品前處理

方法A：在96孔板中，加入50μL血漿樣品和30 μL 內(nèi)標(biāo)工作溶液（900 ng·mL-1）；渦旋 1min，向所有樣品孔中加入370μL甲醇；將密封的96孔板充分振搖 10min 后離心（10℃、4000 r·min-1，10min）；取30μL上清液加至含有570μL 40%甲醇水溶液干凈的96孔板中，渦旋混勻后進(jìn)樣分析。

方法B：在冰浴條件下，向含有800μL甲醇的EP管中加入100μL血漿樣品；振搖10min后在10℃條件下以12 000 r·min-1離心10min； 取30μL上清液加至含有540μL 40%甲醇水溶液的干凈的96孔板中；并向該96孔板中加入30μL內(nèi)標(biāo)工作溶液（60.0 ng·mL-1），渦旋混勻后進(jìn)樣分析。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)研究

本試驗(yàn)方案經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，服從《赫爾辛基宣言》中規(guī)定的倫理原則。經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，臨床批件號為2016L06776。36名中國健康受試者（男女兼有），年齡18～45歲，自愿簽署知情同意書并經(jīng)過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室檢查合格后，平均分為 A、B、C 3 組，分別進(jìn)行低（100mg）、中（200mg）、高（400mg）劑量組的單次給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究，以及中劑量組的多次給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究。

A、B組受試者在空腹?fàn)顟B(tài)下分別單劑量口服1粒苯佐那酯軟膠囊 （100mg/粒、200mg/粒），C組受試者單劑量口服2粒苯佐那酯軟膠囊（200mg/粒）。于給藥前 （0 h） 和給藥后 0.167、0.333、0.5、0.667、0.833、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h 采 集 5 mL 全血。B組受試者單次給藥結(jié)束后，第2天開展多次給藥的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。連續(xù)兩天 （第2天和第3天），每天給藥3次（τ=6 h），第4天單次給藥苯佐那酯軟膠囊1粒。于第3天、第4天給藥前（0 h）和第4 天 藥 后 0.167、0.333、0.5、0.667、0.833、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h 采集 5mL 全血。 其中 2mL 推入至預(yù)冷的采血管B中（EDTA-K2抗凝且含50μL甲硫酸新斯的明儲備液），剩余3mL推入至采血管A中（EDTA-K2抗凝）。將采血管B立刻離心（10℃、4 000 r·min-1，10min）。并在冰浴條件下，取 100 μL離心得到的血漿樣品至含有800μL甲醇的EP管中，渦旋 10min 后離心（10 ℃、12 000 r·min-1，10min）獲取上清液，根據(jù)“方法B”檢測血漿中原始BBA的濃度。采血管A置于室溫條件下2 h后離心（10℃、4 000 r·min-1，10min），離心得到血漿樣品，根據(jù)“方法A”檢測血漿中總BBA的濃度?！睹绹幍洹分赋觯阶裟酋ズ虰BA的摩爾當(dāng)量相等[7]，因此，血漿中苯佐那酯的濃度可根據(jù)公式（1）計(jì)算。隨后，采用Win-Nonlin 6.4計(jì)算BBA和苯佐那酯的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。并通過WinNonlin 6.4和SPSS 19評價(jià)BBA和苯佐那酯的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

在公式（1）中，C表示濃度；MW表示相對分子質(zhì)量；MW苯佐那酯=603.74；MWBBA=193.24。

3 結(jié) 果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證[6]

方法A：此方法選擇性良好，分析物和內(nèi)標(biāo)間無干擾，且不存在殘留問題；在 10.0～10 000 ng·mL-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，以BBA與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（y），以 BBC 質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，得典型的線性回歸方程為y=0.000 451 5C+0.000 270 4，r為 0.999 1；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為-2.0%～1.7%，精密度≤6.0%；內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子為95.6%～100.4%、回收率為86.5%～91.4%；BBA的全血樣品在室溫條件下放置3 h穩(wěn)定性良好；血漿樣品在室溫條件放置18.5 h穩(wěn)定性良好，-70℃條件下5次凍融循環(huán)穩(wěn)定性良好，-70℃條件下長期冰凍27天、87天穩(wěn)定性良好；處理后待進(jìn)樣的溶液在自動(dòng)進(jìn)樣器（8℃）條件下放置8天穩(wěn)定性良好。

方法B：此方法選擇性良好，分析物和內(nèi)標(biāo)間無干擾；高濃度樣品進(jìn)樣后對下一針樣品的檢測不產(chǎn)生影響；典型的線性回歸方程為y=0.000 658 5C+0.000 190 6，r為 0.999 5；RSD 為-4.1%～2.0%， 精密度≤8.4%；內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子為98.5%～109.0%、回收率為98.7%～100.8%；苯佐那酯存在條件下BBA的全血樣品和血漿樣品在冰浴條件下放置2 h穩(wěn)定性良好；苯佐那酯存在條件下BBA的上清液樣品在室溫條件放置18.2 h穩(wěn)定性良好，-70℃條件下4次凍融循環(huán)穩(wěn)定性良好，-70℃條件下長期冰凍27天、89天穩(wěn)定性良好；處理后待進(jìn)樣的溶液在自動(dòng)進(jìn)樣器（8℃）條件下放置9天穩(wěn)定性良好。

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)研究

3.2.1 單次給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究 低 （100mg）、中（200mg）、高（400mg）劑量組受試者單次口服苯佐那酯軟膠囊后，血漿中BBA和苯佐那酯的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2、表3。

圖1 單次給藥后血漿中BBA（A）和苯佐那酯（B）的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

通過SPSS19對不同劑量組的Tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，對t1/2，CL/F和Vd/F進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明劑量對BBA和苯佐那酯的藥代動(dòng)力學(xué)特征均不產(chǎn)生影響（P＞0.05）。通過 WinNonlin 6.4，以冪函數(shù)模型法（PK=α×doseβ）對苯佐那酯的 Cmax和 AUC0-10h進(jìn)行線性關(guān)系評價(jià)[8]，結(jié)果見表4。

3.2.2 多次給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究 中劑量組（200mg）受試者多次口服苯佐那酯軟膠囊后，血漿中BBA和苯佐那酯的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2、表3。

通過SPSS19對BBA和苯佐那酯AUC0-τ進(jìn)行兩配對樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，多次給藥會(huì)使BBA和苯佐那酯在體內(nèi)的暴露量增加。根據(jù)蓄積常數(shù)公式計(jì)算得到 BBA 的 RCmax為 （1.20±0.45），RAUC為（1.10±0.13）； 苯佐那酯的 RCmax為 （1.24±0.57），RAUC為（1.31±0.33）。結(jié)果表明，多次給藥后BBA和苯佐那酯在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生蓄積[9]。

4 討 論

基于BBA和苯佐那酯間的量化關(guān)系，本研究首次提出了間接測定法，通過測定血漿中BBA的濃度推算出了血漿中苯佐那酯的濃度。獲得了BBA及苯佐那酯在體內(nèi)的經(jīng)時(shí)變化過程，估算了BBA和苯佐那酯的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，首次揭示了中國健康受試者口服苯佐那酯軟膠囊后體內(nèi)苯佐那酯及其代謝產(chǎn)物BBA的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

表2 BBA的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=12）

表3 苯佐那酯的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=12）

表4 線性評價(jià)結(jié)果

圖2 多次給藥后血漿中BBA（A）和苯佐那酯（B）的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

單次給藥試驗(yàn)結(jié)果表明，在100～400mg的給藥劑量范圍內(nèi)，苯佐那酯不具有線性藥代動(dòng)力學(xué)特征。多次給藥200mg苯佐那酯軟膠囊后，BBA在體內(nèi)的暴露量約增加9%，苯佐那酯在體內(nèi)的暴露量約增加25%。且多次給藥后BBA和苯佐那酯在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生蓄積。因此，在臨床連續(xù)用藥時(shí)需格外關(guān)注蓄積對藥效的影響。