張建文,王宏亮,鄧 瓊,梁 輝,王 鑄

(深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科,廣東深圳 518109)

前列腺癌是全球男性發(fā)病率最高的癌癥之一,死亡率位居男性腫瘤的第2位[1-2],并且其發(fā)病率還在不斷攀升。統計分析認為,到2030年,在高于65歲的男性人群中前列腺癌患者將占到19.6%[3]。近年來,隨著我國社會經濟的發(fā)展、生活條件的不斷改善、老年人口比例的逐漸增多以及臨床診斷技術水平的快速提高,前列腺癌的發(fā)病率在我國男性人群中逐年升高[4]。

前列腺癌病情易被忽視,晚期前列腺癌惡化速度顯著加快,通常都會發(fā)展成為去勢抵抗前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)并且容易轉移到其他內臟器官,例如骨骼和淋巴結[5-6]。面對晚期癥狀性CRPC,目前臨床上基本沒有有效的治療手段,預后極差[7]。到目前為止,前列腺癌的確切發(fā)病以及進展機制尚未完全清楚。因此,對于前列腺癌的研究，尤其是對CRPC發(fā)生發(fā)展機制的研究十分迫切。本研究中發(fā)現維甲酸相關的孤兒核受體β(retinoic acid-related orphan receptor β,RORβ)在前列腺癌組織中顯著上調表達,并且在前列腺癌腫瘤干細胞富集的腫瘤多細胞球中表達水平進一步升高。我們還構建了基于VCaP細胞的CRPC小鼠模型,發(fā)現在腫瘤復發(fā)階段RORβ表達水平顯著高于去勢之前的腫瘤標本。我們在VCaP-CRPC模型的腫瘤復發(fā)階段,發(fā)現了腫瘤干細胞相關標記物陽性細胞比例顯著高于去勢之前的腫瘤標本。通過外源性過表達的方式在前列腺癌細胞中過表達RORβ的表達水平,并通過腫瘤多細胞球形成實驗,以及抗雄激素藥物處理發(fā)現RORβ過表達的前列腺癌細胞具有顯著增強的腫瘤多細胞球形成能力,并具有更強的抗雄激素藥物耐受能力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料前列腺癌細胞株DU145、LNCaP和VCaP購自美國模式培養(yǎng)物集存庫,分別用含有10%胎牛血清(forward-based system,FBS)的MEM培養(yǎng)基(Gibco minimum eagle’s media,MEM),RMPI1640(Gibco RPMI 1640 medium)以及DMEM培養(yǎng)基(Gibco Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)。鼠抗人RORβ單抗購自Abcam公司(貨號：ab228650),鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz生物科技公司(貨號：sc-47778)；RORβ基因的表達克隆從DNASU Plasmid Repository購買(ID：HsCD00300034)。

1.2 實驗方法

1.2.1前列腺癌多細胞球培養(yǎng) 前列腺癌細胞通過胰酶(0.05% Trypsin-EDTA)消化成單個細胞后,用PBS洗3次,DMEM/F12培養(yǎng)基[添加10 ng/mL表皮生長因子,10 ng/mL 堿性成纖維細胞因子,2% B-27(體積分數),5 μg/mL胰島素,1%敲除替代血清(體積分數),1%青霉素和鏈霉素(體積分數)]重懸,按照1×105個細胞接種到100 mm超低吸附培養(yǎng)皿(ultra-low attachment dishes and plates,康寧,美國)。37 ℃條件下培養(yǎng)5 d后,每2～3 d更換培養(yǎng)基至2周,用孔徑80 μm的濾膜過濾收集細胞球用于后續(xù)實驗研究。

1.2.2VCaP-CRPC動物模型建立 將前列腺癌VCaP細胞(2×106個細胞/50 μL與基質膠1∶1混合)皮下注射到6～8周齡雄性嚴重免疫力缺乏綜合癥(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠體內,每周觀察并測算腫瘤體積1次,腫瘤體積約0.8 cm3時,宿主小鼠被麻醉并施行去勢手術,正常飼養(yǎng)至約14周,復發(fā)的腫瘤異種移植物生長至約1.2 cm3,施行麻醉過量人道處死小鼠并去除瘤體。分別在進行去勢手術前,去勢后4 d以及去勢后8周(腫瘤去勢復發(fā))收取腫瘤標本,用于RORβ基因mRNA以及蛋白表達分析。

1.2.3Oncomine數據分析 在Oncomine(http:∥www.oncomine.org)分析中,使用癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)數據庫,在前列腺癌臨床樣本和正常前列腺組織中分析RORβ基因的mRNA表達水平。用于分析的參數包括RORβ(NR1F2)為基因名稱,以前列腺癌為分析對象,以癌癥與正常組織中的表達水平作為分析類型。用于查詢微陣列數據閾值：包括癌組織和正常組織之間的表達差異>2,P<1×10-4。

1.2.4RORβ過表達載體構建 RORβ基因克隆購自DNASU Plasmid Repository(Arizona State University),通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增獲取全長cDNA,并將其克隆入慢病毒質粒pLenti-puro進行過表達研究。將構建的pLenti-RORβ質粒轉染到293FT細胞進行慢病毒包裝制備(實驗組),空的pLenti-puro載體包裝作為陰性對照(對照組)。包裝好的病毒分別用來感染LNCaP和DU145細胞,分別通過實時定量聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫印跡(Western blot)分析驗證RORβ蛋白水平的表達。

1.2.5RT-PCR實驗 使用抽提試劑(Trizol)法提取細胞以及腫瘤組織總RNA,并用脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)處理。使用PrimeScript RTase和oligo-dT(PrimeScript RT Master Mix,TaKaRa)的混合物在37 ℃下15 min合成第一鏈cDNA,然后在85 ℃下5 s熱滅活逆轉錄酶(RTase)。使用熒光定量檢測試劑盒綠色熒光的方法進行實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)。通過混合25 ng cDNA,150 nmol/L引物對和熒光定量混合物(SYBR Premix Ex Taq,ROX Plus,TaKaRa)并在實時PCR系統(StepOne,Applied Biosystems)中以95 ℃ 20 s進行PCR反應,隨后再以95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s為一個循環(huán)周期進行40次。

1.2.6Western blot實驗 使用冷裂解緩沖液(20 mmol/L PIPES,0.1%十二烷基硫酸鈉,1 mmol/L乙二胺四乙酸,1 mmol/L乙二醇雙四乙酸,10 mmol/L一硫代甘油,1 mmol/L蛋白酶抑制劑,5 mmol/L亮抑酶肽,0.25 mol/L蔗糖)提取全細胞蛋白。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分離和轉印到聚偏氟乙烯膜上后,一級和二級抗體孵育,隨后用免疫印跡檢測系統(ECL Western blotting detection system,amersham)檢測。

1.3 統計學分析統計學處理采用SPSS 13.0軟件。定量資料進行單因素方差分析(One-way ANOVA),方差不齊者采用秩和檢驗分析,樣本間的兩兩比較采用最小顯著性差異法(least significant difference,LSD)方法分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RORβ在前列腺癌組織中表達水平顯著升高通過生物信息學方法分析發(fā)現RORβ在前列腺癌臨床樣本中的表達水平顯著升高(圖1)。在兩個獨立的研究中,分別調查了65例和27例前列腺癌臨床樣本,正常前列腺對照組分別有23例和8例。研究發(fā)現,相對于正常前列腺組織,RORβ在前列腺癌組織中顯著升高(P<0.001)。

圖1 RORβ在前列腺癌組織中表達水平升高

2.2 RORβ在前列腺癌多細胞模型中的表達水平顯著升高分析RORβ基因在前列腺癌細胞LNCaP、VCaP以及DU145細胞多細胞球(prostatospheroids)中的表達(圖2A、B)。結果顯示,無論是雄激素依賴型(LNCaP、VCaP)還是雄激素非依賴型細胞株(DU145)形成的多細胞球,RORβ基因都發(fā)生了顯著的上調表達,其中在LNCaP細胞中的表達上調最為顯著(圖2C,P<0.001),Western blot驗證了RORβ在蛋白水平的上調表達(圖2D)。

圖2 RORβ在前列腺癌多細胞模型中的表達水平顯著升高

2.3 RORβ在前列腺癌去勢抵抗動物模型中的表達水平顯著升高我們通過構建CRPC小鼠模型,分析RORβ在CRPC小鼠模型的各個階段的表達情況,結果顯示在去勢過程中,RORβ表達顯著上調,隨著腫瘤的復發(fā)RORβ表達水平有所下降,但仍然顯著高于去勢手術前的表達水平(圖3A)。在去勢手術后CRPC小鼠模型各個階段腫瘤標本中腫瘤干細胞相關標記物(CD44、CD133、OCT4、CK5等)的表達水平顯著升高(圖3B)。另外,在CRPC模型中RORβ蛋白表達水平顯著升高(圖3C)。我們通過流式細胞儀(fluorescence-activated cell sorting,FACS)分析VCaP-CRPC組織標本中CD44+/CD133+細胞,結果顯示CD44+/CD133+陽性細胞比例顯著升高。

圖3 RORβ在前列腺癌去勢抵抗動物模型中的表達水平顯著升高

A：RORβ在VCaP-CRPC模型中的表達水平；B：VCaP-CRPC模型中前列腺癌干細胞標記物表達,*P<0.05,**P<0.001；C：VCaP-CRPC模型中RORβ蛋白表達水平。

2.4 RORβ在前列腺癌細胞中的過表達促進前列腺癌腫瘤干細胞富集的多細胞球的形成通過構建RORβ真核表達載體,我們分別在DU145(雄激素非依賴型細胞)和LNCaP(雄激素依賴型細胞)細胞中外源性過表達RORβ,在mRNA以及蛋白水平的表達(圖4A、B),RORβ的過表達顯著促進前列腺癌腫瘤干細胞富集的腫瘤多細胞球的形成(圖4C、D)。

圖4 RORβ在前列腺癌細胞中的過表達促進前列腺癌腫瘤干細胞富集的多細胞球的形成

A、B：RORβ過表達載體在DU145和LNCaP細胞中的表達驗證；C、D：RORβ過表達促進DU145和LNCaP多細胞球的形成。*P<0.05,**P<0.001。

3 討 論

前列腺癌干細胞(prostate cancer stem cell,PCSC)被認為是前列腺癌的起始細胞,不僅可以分化成前列腺癌細胞,還具有自我更新能力,保持自身在腫瘤細胞中的一定比例。前列腺癌干細胞因對化療和放療不敏感,而且雄激素受體表達陰性,對雄激素治療不敏感,是導致前列腺癌復發(fā)以及CRPC進展的重要機制[10]。

本項研究中,我們發(fā)現核受體RORβ在前列腺癌細胞以及CRPC動物模型中顯著上調表達,并且通過真核載體外源性的上調RORβ表達可以顯著促進前列腺癌干細胞富集的腫瘤多細胞球的形成。核受體是一類轉錄因子超家族,其通過配體依賴性或者配體非依賴性的方式調控下游基因表達,在新陳代謝、生殖、發(fā)育等生理過程中起著重要的作用[11]。RORβ可能通過調節(jié)腫瘤干細胞相關信號通路和蛋白因子從而介導了前列腺癌干細胞的自我更新和分化。因此,RORβ可能成為治療CRPC潛在的新靶點。

研究發(fā)現,核受體配體結合域可以被天然代謝產物、激素或者小分子藥物結合,并由此調節(jié)其轉錄活性,因此被認為是癌癥治療的理想靶點。例如糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor,GR)可以拮抗雄激素受體(androgen receptor,AR)信號通路,因此GR通常也作為單獨化療或者聯合治療手段應用于CRPC的治療[12-13]；維生素D受體可以和AR信號通路發(fā)生交互作用,調節(jié)雄激素代謝過程并抑制前列腺癌細胞的增殖[14]。到目前為止,已經有多種靶向核受體的小分子藥物上市或者進入臨床試驗。例如靶向雌激素受體(estrogen receptor,ER)的小分子雌激素拮抗藥它莫西芬(Tamoxifen)和特異性更高的雷洛昔芬(Raloxifene),被用于治療乳腺癌[15],靶向AR的非甾體類小分子藥物Flutamide、Bicalutamide、MDV-3100,被用于治療前列腺癌[16],靶向核受體PPARs的激動劑(Thiazolinediones,TZDs)被用于治療2型糖尿病、脂肪肉瘤和結腸癌[17]等。

RORβ屬于孤兒核受體家族,在維持各種生理過程和生理節(jié)律方面起著重要的調節(jié)作用[16]。晝夜節(jié)律異常越來越被認為是腫瘤發(fā)生的重要誘因[18-19]。因此,闡明RORβ的分子機制,調節(jié)腫瘤相關晝夜節(jié)律異?？赡軐τ行Ц深A和阻斷異常晝夜節(jié)律誘導的腫瘤發(fā)生產生重要的臨床益處[18]。目前RORβ基因異常表達與人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展的關系日益受到關注。RISINGER等[21]對79例子宮內膜癌以及12例1期漿液性子宮內膜癌研究發(fā)現,相對于正常子宮內膜組織,RORβ在組織中顯著低表達[20]。另外,研究表明在結直腸癌中也發(fā)現RORβ在癌組織中顯著下調表達。然而,DAVIDSON等[20]在原發(fā)性子宮肌肉瘤中發(fā)現RORβ表達顯著上調。但是,RORβ激活或者抑制腫瘤生長的調控機制尚不明確。

有研究通過mRNA FISH和RT-PCR方法檢測發(fā)現RORβ在胃癌組織中下調,RORβ通過與Nrip2/Rorl3/HBPl分子間的相互作用影響Wnt/β-catenin信號通路活性而調控大腸癌細胞自我更新[21-23]。Wnt/β-catenin可以直接作用于腫瘤干細胞因子Nanog和Oct4啟動子上調其表達水平,從而促進腫瘤干細胞干性維持過程[24]。因此RORβ促進前列腺癌多細胞球的形成可能與Wnt/β-catenin信號以及Nanog和Oct4的表達調控有關。另外,GREINER等[25]新發(fā)現NIX1通過第61～99個氨基酸與RORβ相互作用,直接結合RORβ且特異性地抑制其活性。RORβ的異常表達可能與其上游信號,包括NIX1的表達有關。

綜上所述,核受體RORβ在前列腺癌細胞以及CRPC動物模型中上調表達,并可能通過Wnt/β-catenin信號通路介導Nanog以及Oct4的表達從而促進前列腺癌干細胞富集的多細胞球的形成。這表明RORβ很可能通過調控前列腺癌干細胞干性從而促進了前列腺癌去勢抵抗進展,提示核受體RORβ有可能是一個潛在的前列腺癌進展標記物和治療靶點,但是其相關信號通路以及調控機制仍不清楚亟待進一步研究。