劉 迅，陳 林，何平林，王 凱，劉俊瑩，陳書練，楊 進(jìn)，羅 旭

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州遵義 563000；2.成都大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，四川成都 610081；3.成都大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610081)

穿刺活檢術(shù)是臨床上診斷腫瘤或某些癌前病變最重要、最準(zhǔn)確的方法之一，是國(guó)際公認(rèn)的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但膀胱腫瘤的診斷目前臨床仍采取傳統(tǒng)的影像學(xué)或經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(transurethral bladder tumor resection，TUR-BT)等方法。然而影像學(xué)檢查并非完全可靠，只能作為初步篩查方法。TUR-BT既為重要診斷方法，也為主要治療手段，但腫瘤的病理分級(jí)及分期都需要借助首次TUR-BT后的病理檢查獲得，大部分患者往往需要進(jìn)行二次手術(shù)，增加腫瘤分期提前以及殘留癌的風(fēng)險(xiǎn)[1]，且該方法創(chuàng)傷較大,有時(shí)取不到膀胱肌層，無(wú)法準(zhǔn)確判斷腫瘤分期，影響進(jìn)一步治療決策。另一方面，在探究膀胱功能障礙的病理生理過程中，動(dòng)物模型的使用是必不可少的[2]。傳統(tǒng)取膀胱活檢的方法主要是通過解剖刀在膀胱壁的一側(cè)切下一塊組織，然后再將膀胱對(duì)合逐層縫合[3]。該操作不僅過程繁瑣，且創(chuàng)傷性較大，所需愈合時(shí)間長(zhǎng)，不利于對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的進(jìn)一步操作。如若可將膀胱穿刺術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，即可避免手術(shù)操作給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物帶來(lái)較大創(chuàng)傷，又可得到相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這將為膀胱研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供新型的膀胱組織提取方法，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn)，雙孔鉀離子通道(TWIK related K+channel 1，TERK-1)是正常人膀胱逼尿肌中調(diào)節(jié)機(jī)械牽拉刺激的主要離子通道之一，其為雙孔結(jié)構(gòu)的機(jī)械門控鉀通道(two-pore-domain mechano-gated potassium channel，K2P)亞家族中的主要表達(dá)成員[4]。且研究已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)膀胱逼尿肌進(jìn)行性充盈時(shí)TERK-1具有穩(wěn)定膜電位的作用，從而降低膀胱興奮性和防止發(fā)生收縮排尿[5]。先前有學(xué)者觀察到，TERK-1在膀胱出口梗阻小鼠的逼尿肌中表達(dá)下調(diào)[6]。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地將膀胱穿刺活檢術(shù)應(yīng)用于膀胱出口部分梗阻大鼠，通過觀察不同梗阻時(shí)間膀胱逼尿肌的形態(tài)學(xué)變化及膀胱組織中TERK-1通道的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)并討論膀胱穿刺活檢術(shù)在臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物該實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將18只Sprague-Dawley雌性大鼠(體重250～280 g，8～12周齡，中國(guó)成都，達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，分為對(duì)照組(n=6)、梗阻14 d組(n=6)和梗阻28 d組(n=6)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，保持在光控(12 h光照/黑暗循環(huán))籠中，每個(gè)籠子有3只大鼠，可自由攝取食物和水。

1.2 建立膀胱出口部分梗阻模型本實(shí)驗(yàn)采用CHEN等[7]的新型膀胱出口部分梗阻模型建立方法,即尿道外口梗阻法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)大鼠模型的建立，為保證動(dòng)物模型的一致性，所有手術(shù)均由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的外科醫(yī)生操作。具體操作為，吸入異氟烷麻醉大鼠,消毒下腹部及尿道外口，將小兒靜脈留置導(dǎo)管(G 26，內(nèi)徑=0.4 mm，外徑=0.6 mm，16 mm)經(jīng)尿道插入大鼠膀胱，將不可吸收的6-0帶線縫合針(杭州艾普醫(yī)療器械有限公司，杭州，中國(guó))在12點(diǎn)鐘位置縱向穿過尿道口，在尿道口的6點(diǎn)鐘方向穿出并打結(jié)?？p線結(jié)形成后移除導(dǎo)管，以產(chǎn)生下尿路梗阻癥狀。

1.3 膀胱穿刺常規(guī)麻醉、消毒后，取下腹部正中切口，長(zhǎng)約1.5～2 cm，逐層切開皮膚及皮下組織，鈍性分離腹壁肌肉，打開腹膜，將充盈膀胱輕輕提起，采用臨床上使用的全自動(dòng)型活檢針(G 18，長(zhǎng)150 mm，針突長(zhǎng)22 mm)垂直穿過膀胱前后壁，激發(fā)活檢槍后抽出。取標(biāo)本時(shí)應(yīng)盡量取到膀胱壁全層，將標(biāo)本浸泡于4%多聚甲醛溶液質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)中固定。固定1 d后用石蠟包埋，將包埋好的組織切成薄切片(5 mm)，舒展開置于載玻片上，放入45 ℃的恒溫箱中烘干。

1.4 HE染色將切片置于二甲苯中脫蠟后，依次放入無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、75%、85%乙醇(體積分?jǐn)?shù))中水化，蘇木素染色5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍(lán)，水洗，入伊紅染液中染色5 min。由低到高逐級(jí)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 免疫組織化學(xué)染色采用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化技術(shù)流程操作，將石蠟切片脫蠟水化，步驟同1.4，將切片浸在檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)中，置于微波爐內(nèi)煮沸20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后，滴加3%(體積分?jǐn)?shù))雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育25 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗。將配好的5%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白溶液(albumin from bovine serum，BSA)覆蓋組織，封閉30 min后，滴加1∶100的一抗(K2P2.1，Alomone labs APC-O47)，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。PBS溶液沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育50 min，再次PBS溶液沖洗3次，滴加現(xiàn)配制的DAB顯色液(Dako REALTM EnVisionTM Detection System,Peroxidase/DAB+,Rabbit/Mouse)，顯微鏡下觀察染色程度把握終止顯色時(shí)間。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，1%鹽酸乙醇(體積分?jǐn)?shù))分化，流水沖洗，由低到高逐級(jí)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。將封好的玻片放在200倍光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為TERK-1通道蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，我們根據(jù)著色強(qiáng)度通過圖像分析軟件(Image Pro Plus 6.0)對(duì)TERK-1通道表達(dá)情況進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，定義P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色200倍光學(xué)顯微鏡下可觀察到對(duì)照組大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞體積適中、排列緊湊、肌纖維分布均勻，但在標(biāo)本中未能觀察到膀胱上皮結(jié)構(gòu)；與對(duì)照組相比，14 d梗阻組和28 d梗阻組的大鼠膀胱肌纖維束排列紊亂、形態(tài)不規(guī)則，肌間隙明顯增寬，肌細(xì)胞肥大，膀胱平滑肌橫截面明顯增厚(圖1A～C)。

2.2 大鼠膀胱壁中TERK-1通道分布及表達(dá)情況結(jié)果表明，SD大鼠膀胱中TERK-1通道的表達(dá)隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸下降趨勢(shì)，梗阻28 d的大鼠比對(duì)照組大鼠表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.122，P=0.035，圖1D～G)。

圖1 采用膀胱穿刺活檢技術(shù)獲得的正常和梗阻膀胱組織觀察

A：對(duì)照組(HE，×200)；B：梗阻14 d組(HE，×200)；C：梗阻28 d組(HE，×200)；D：對(duì)照組(TERK-1，×200)；E：梗阻14 d組(TERK-1，×200)；F：梗阻28 d組(TERK-1，×200)；圖B、C中箭頭所指為膀胱平滑肌病理性肥厚擴(kuò)張；圖D、E、F中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為TERK-1通道蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞；G：免疫組化TERK-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。

3 討 論

膀胱的急性充盈期同時(shí)受到神經(jīng)源性和肌源性的共同調(diào)節(jié)，該機(jī)制可降低膀胱內(nèi)壓力以適應(yīng)進(jìn)行性尿量增加導(dǎo)致的膀胱容積的急劇擴(kuò)增。在長(zhǎng)期的膀胱出口梗阻中，持續(xù)的膀胱高壓可引起膀胱壁的慢性缺血缺氧和去神經(jīng)化作用，從而導(dǎo)致膀胱功能障礙[8-10]。但急性的膀胱出口梗阻由于傳入膀胱神經(jīng)沖動(dòng)的增加，可導(dǎo)致膀胱逼尿肌的過度活動(dòng)，是導(dǎo)致膀胱平滑肌的代償性肥大的機(jī)制之一[11]。已經(jīng)證明，在膀胱出口梗阻4周時(shí)，即可出現(xiàn)膀胱逼尿肌的明顯增厚與肥大[12]，該結(jié)論與本研究結(jié)果一致(圖1C)。

此外，肌源性學(xué)說(shuō)在調(diào)節(jié)膀胱興奮性的機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[13]。目前，研究者已經(jīng)證實(shí)了幾種類型的機(jī)械敏感K+通道的作用[14]。為了進(jìn)一步證實(shí)穿刺標(biāo)本的可應(yīng)用性，我們選擇了目前研究相對(duì)成熟的TERK-1機(jī)械門控鉀離子通道，該通道蛋白廣泛分布于膀胱尿路上皮和平滑肌層組織中，陽(yáng)性表達(dá)率高，便于觀察染色結(jié)果[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱平滑肌充盈、拉伸過程中，TERK-1發(fā)揮了穩(wěn)定逼尿肌膜電位的重要作用，其表達(dá)的減少可能是導(dǎo)致膀胱逼尿肌過度活動(dòng)的一個(gè)重要因素。通過對(duì)穿刺膀胱標(biāo)本進(jìn)行TERK-1抗體的免疫組化染色，我們發(fā)現(xiàn)該通道蛋白隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯下降趨勢(shì)(圖1D～G)，與已知結(jié)論相吻合，進(jìn)一步證明了穿刺組織標(biāo)本的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本研究中，我們針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱穿刺活檢技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了探討，證明利用穿刺針取出的膀胱組織標(biāo)本足以用于HE染色及免疫組化等病理學(xué)分析研究。經(jīng)化學(xué)染色后，在光鏡下可清楚觀察到膀胱肌層形態(tài)及排列方式，與傳統(tǒng)方法取出的組織標(biāo)本相比，鏡下形態(tài)差異并不顯著。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)了解到，這是首次將膀胱穿刺活檢技術(shù)應(yīng)用于大鼠，不僅以微創(chuàng)的方法成功提取了膀胱組織，保留了膀胱結(jié)構(gòu)的完整性，降低了腹腔感染及膀胱與腹壁粘連的幾率，更重要的是該標(biāo)本可清楚觀察到梗阻大鼠膀胱逼尿肌的形態(tài)學(xué)變化，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。但該方法也存在一定的局限性，從HE染色標(biāo)本中，我們未能觀察到膀胱內(nèi)整齊排列的移行上皮細(xì)胞，可能是由于穿刺過程中穿刺針破壞了上皮結(jié)構(gòu)。其次，由于穿刺的組織體積較小，可提取的蛋白量可能較少，因此，不適宜利用蛋白印跡法對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行半定量分析。

所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都是為臨床應(yīng)用做準(zhǔn)備，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者探索了臨床上影像學(xué)輔助下的膀胱穿刺活檢技術(shù)對(duì)于肌層浸潤(rùn)性膀胱癌病理診斷的實(shí)際意義。早在1991年，HOSHI等[16]日本學(xué)者報(bào)道了關(guān)于超聲引導(dǎo)下的經(jīng)皮膀胱全層穿刺活檢技術(shù)，初步探索了肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者在放療或化療等新輔助治療過程中對(duì)腫瘤分期的判斷及治療效果的評(píng)價(jià)。隨后，MALMSTROM等[17]進(jìn)一步探究了經(jīng)計(jì)算機(jī)斷層掃描(computer tomography，CT)引導(dǎo)的經(jīng)皮膀胱穿刺活檢技術(shù)，再次證實(shí)穿刺技術(shù)可以收集足夠的有價(jià)值的病理學(xué)材料。近幾年，國(guó)內(nèi)也有學(xué)者證實(shí)了超聲引導(dǎo)下的膀胱穿刺活檢技術(shù)對(duì)腫瘤性質(zhì)的鑒別是一種行之有效的方法[18]。雖然穿刺活檢技術(shù)與傳統(tǒng)的TUR-BT相比，具有安全、高效、操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，但CHLOSTA等[19]也提出應(yīng)用該方法判斷膀胱原位癌或淺表性腫瘤具有一定的缺陷。由于相關(guān)臨床研究較少，關(guān)于膀胱穿刺是否會(huì)導(dǎo)致腫瘤的種植轉(zhuǎn)移，目前還沒有明確定論，但有學(xué)者認(rèn)為，因穿刺而導(dǎo)致的播散幾率不應(yīng)大于大范圍的TUR-BT[20]。雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)其他相關(guān)并發(fā)癥，但畢竟臨床樣本量有限，對(duì)于該方法是否可以完全取代TUR-BT，還需進(jìn)一步的探究。

綜上所述，膀胱穿刺術(shù)以微創(chuàng)的方法成功收集了組織標(biāo)本用于形態(tài)學(xué)及病理學(xué)檢測(cè)，可保留膀胱結(jié)構(gòu)完整，降低腹腔感染及膀胱與腹壁粘連的幾率，使得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有可能重復(fù)利用，是可行的操作方法。