韓玉竹，胡鴻晴，玉永雄，張朝鵬，范紫薇

（1. 西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 / 重慶市肉牛工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460；2. 西南大學(xué)動物科技學(xué)院 /重慶市高校草食動物工程中心，重慶 北碚 400715）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種優(yōu)良的多年生豆科牧草，在世界各地廣泛栽培，具有營養(yǎng)價值高和家畜喜食等特點，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著極其重要的作用[1]。然而，病蟲害已成為限制苜蓿產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的重要因素[2]。目前，苜蓿上已報道約90余種病害，其中苜?；ㄈ~病是主要病害之一[3]。引起苜?；ㄈ~病的病原主要是苜蓿花葉病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)，另外還有豇豆花葉病毒(cowpea mosaic virus, CPMV)、白三葉花葉病毒(white clover mosaic virus, WCMV)、菜豆花葉病毒(bean yellow mosaic virus, BYMV)、三葉草黃葉脈病毒(clover yellow vein virus, CYVV)、紅三葉草明脈花葉病毒(red clover vein mosaic virus, RCVMV)和花生矮化病毒(peanut stunt virus, PSV)等，對苜蓿生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失[4-5]。據(jù)文獻報道，苜蓿病毒病在苜蓿種植區(qū)普遍發(fā)生，寧夏的苜?；ㄈ~病的發(fā)病率為15%～95%[6]，甘肅省蘭州市和白銀市苜蓿花葉病的發(fā)病率為16.08%～43.33%，且隨著年限增長呈上升趨勢[4]。苜?；ㄈ~病可導(dǎo)致苜蓿植株矮化、葉片皺縮變黃甚至脫落，牧草蛋白質(zhì)含量下降，根瘤數(shù)減少31%～67%，牧草干重降低37%～66%，花粉萌發(fā)率降低21.5%，種子減產(chǎn)，易受干旱或霜凍的危害，易被其他病害侵染[3,7-8]。

國內(nèi)外學(xué)者對苜?；ㄈ~病進行了大量的研究，主要包括病原檢測[4-5]，病原的結(jié)構(gòu)基因[9-10]、寄主范圍、分布和危害[8]、發(fā)病規(guī)律[11]和綜合防治[12]等方面。但關(guān)于病害對苜蓿生長、產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)的研究較少，且不深入，對光合作用的影響還未見報道。光合同化是影響產(chǎn)量和質(zhì)量的主要因素，因此有必要明確不同嚴(yán)重度花葉病對苜蓿葉片光合作用的影響程度。本研究以紫花苜蓿為材料，分析不同嚴(yán)重度花葉病對葉片光合作用、植株生長及草品質(zhì)的影響，并分析不同指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系，以期為闡明花葉病侵染導(dǎo)致苜蓿產(chǎn)量和草品質(zhì)降低的機理提供思路，也為牧草病害損失估計、指導(dǎo)苜蓿花葉病害田間防治及牧草合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

采樣地點位于重慶市榮昌區(qū)西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院苜?；?(29°41' N，105°44' E，海拔 281.5 m)。屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，年均降水量為1 099 mm；年平均氣溫18.5 ℃，年最高氣溫39.9 ℃，年最低氣溫2.5 ℃，無霜期327 d以上。土壤類型為砂壤土，土壤pH為6.25。

1.2 試驗材料

研究材料為日本引進的抗倒伏紫花苜蓿品種“Neo-tachiwakaba”，試驗地種植年限為3年，苜?；ㄈ~病當(dāng)年發(fā)病率達85%。試驗前期利用DASELISA和病毒特異性引物對病株病原進行檢測，證明該樣地苜?；ㄈ~病害的病原為苜蓿花葉病毒(AMV)。

1.3 試驗方法

1.3.1 苜?；ㄈ~病嚴(yán)重度分級

根據(jù)苜蓿花葉病害的田間癥狀，以整株為單位，將嚴(yán)重度分為5級，即，0級：全株無?。?級：輕微花葉，或上部1/3葉片花葉但不變形；2級：1/3～1/2葉片出現(xiàn)花葉癥狀，或者少數(shù)葉片出現(xiàn)變形，病株矮化約1/4；3 級：整株1/3～2/3葉片出現(xiàn)花葉癥狀，葉或葉柄變形，或者植株矮化1/3左右；4級：整株葉片花葉，葉片變形嚴(yán)重或壞死，病株矮化為正常植株的1/4～3/4。

1.3.2 取樣時間及方法

2017年9月中旬至下旬，于紫花苜蓿第3茬初花期進行取樣。隨機選取5塊樣地，每樣地根據(jù)苜蓿花葉病的不同嚴(yán)重度隨機選取20株，測定光合和生長指標(biāo)后，帶回實驗室進行生物量和營養(yǎng)指標(biāo)的測定。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 光合指標(biāo)

選擇晴朗光照充足的天氣，于08:30-11:00選擇健康成熟的功能葉片(植株自上向下第3-4片三出復(fù)葉的中間葉，利用Li-6400便攜式光合儀(紅藍光源)進行凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)的測定[13-16]。葉綠素含量測定采用丙酮-乙醇混合提取法。

1.4.2 生長指標(biāo)

以株為單位，測定紫花苜?；ㄈ~病不同發(fā)生程度的生長指標(biāo)。生物量為植株地上部分干重；株高為植株和地面垂直時的高度；分枝數(shù)為地面以上單株側(cè)枝的數(shù)量；葉長和葉寬分別測量植株自上向下第3片復(fù)葉頂端小葉的長度和寬度[17]。

1.4.3 品質(zhì)指標(biāo)

參照蘭云賢等的方法[18]，對不同病害嚴(yán)重度植株的常規(guī)營養(yǎng)成分(粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、鈣、磷)進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

分別采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，差異顯著性選用LSD法，相關(guān)性分析選用Pearson相關(guān)顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 對光合特性的影響

葉綠素的含量隨著花葉病的嚴(yán)重度增加而降低，嚴(yán)重度為3級及以上與健株的葉綠素含量存在極顯著差異(P ＜ 0.01) (表1)。嚴(yán)重度為4級時，病葉葉綠素含量僅為健株的64.84%。

苜蓿花葉病顯著影響紫花苜蓿的光合速率，隨苜蓿花葉病害嚴(yán)重度增加，凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)顯著降低，胞間CO2濃度(Ci)增高。嚴(yán)重度1級及以上時，這4個光合指標(biāo)與健株存在極顯著差異 (P ＜ 0.01)。Pn從 14.63 μmol·(m2·s)-1降 到 4.24 μmol·(m2·s)-1， 降 低 了 71.02%， Tr從4.23 mmol·(m2·s)-1降 為 2.15 mmol·(m2·s)-1， 降低 了49.17%， Gs從 0.23 mmol·(m2·s)-1降 為 0.11 mmol·(m2·s)-1，降低了53.33%。當(dāng)病害嚴(yán)重度為4級時，其Pn僅為健株的6.70%，Tr和Gs分別下降了65.4%和40%，Ci比健株增加了42.66%。苜蓿花葉病害嚴(yán)重度與光合參數(shù)的相關(guān)性分析顯示，葉綠素含量、Ci濃度與嚴(yán)重度極顯著相關(guān)；Pn、Tr與嚴(yán)重度顯著負相關(guān)；Gs與嚴(yán)重度無顯著相關(guān)性(表2)。

2.2 對苜蓿生長狀況的影響

紫花苜蓿感染苜?；ㄈ~病毒后，分枝數(shù)沒有顯著變化，但植株矮化，葉片皺縮褪綠斑駁，紫花苜蓿生物量、株高、葉寬、葉長隨嚴(yán)重度增加呈下降趨勢(P ＜ 0.01) (表3)。嚴(yán)重度1級及以上的病株單株生物量和株高顯著低于健株(P ＜ 0.05)，病級2級及以上的病株葉寬顯著低于健株(P ＜ 0.05)。嚴(yán)重度為4級時病株單株生物量較健株下降29.50%(P ＜ 0.01)，矮化 28.74% (P ＜ 0.01)，葉寬減少 39.84%(P ＜ 0.01)，葉長減少 26.27% (P ＜ 0.01)。

表 1 花葉病害不同嚴(yán)重度植株的光合生理指標(biāo)Table 1 Effect of alfalfa mosaic disease severity on the photosynthetic indexes of alfalfa

表 2 不同嚴(yán)重度花葉病害與苜蓿光合指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation between alfalfa photosynthesis and alfalfa mosaic disease severity

表 3 不同嚴(yán)重度花葉病害的紫花苜蓿生長狀況Table 3 Effect of alfalfa mosaic disease severity on alfalfa growth status

苜蓿生長指標(biāo)與花葉病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析表明，株高、葉寬與嚴(yán)重程度呈極顯著負相關(guān)(P ＜0.01)；生物量、葉長和嚴(yán)重度顯著負相關(guān)(P ＜ 0.05)，分枝數(shù)與病害無顯著相關(guān)性(P ＞ 0.05) (表4)。

2.3 對苜蓿飼草品質(zhì)的影響

紫花苜蓿感染苜?；ㄈ~病后，隨著病害嚴(yán)重度的增加，粗蛋白(CP)和粗脂肪(EE)含量降低，酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)含量增加，粗灰分(Ash)、鈣(Ca)和磷(P) 含量上升(表5)。嚴(yán)重度Ⅰ級及以上病株EE與健株差異極顯著(P ＜ 0.01)，ADF含量差異顯著(P ＜ 0.05)；嚴(yán)重度2級及以上病株CP與健株差異極顯著(P ＜ 0.05)，NDF含量差異顯著(P ＜ 0.05)；嚴(yán)重度3級及以上病株Ca與健株差異顯著(P ＜ 0.05)；嚴(yán)重度4級病株P(guān)與健株差異顯著(P ＜ 0.05)。與健株相比，當(dāng)病害嚴(yán)重度為4級時，病株CP含量下降42.70%，EE含量降低70.82%，ADF和NDF含量分別增加49.29% 和23.99%。說明苜蓿花葉病嚴(yán)重影響了苜蓿的飼用品質(zhì)。

從苜?；ㄈ~病嚴(yán)重度與飼草營養(yǎng)成分的相關(guān)性分析結(jié)果來看，CP、EE含量與嚴(yán)重度極顯著負相關(guān)，ADF、NDF、Ash、Ca、P含量與嚴(yán)重度顯著正相關(guān) (表 6)。

表 4 不同病害嚴(yán)重度與苜蓿生長指標(biāo)的相關(guān)性Table 4 Correlation between alfalfa growth and alfalfa mosaic disease severity

表 5 不同嚴(yán)重度花葉病害的苜蓿營養(yǎng)成分含量Table 5 Effect of alfalfa mosaic disease severity on alfalfa nutritional components

2.4 對苜蓿生長、品質(zhì)和光合作用的綜合影響

分枝數(shù)與各光合指標(biāo)之間無顯著相關(guān)性(P ＞ 0.05)；地上生物量與Pn顯著正相關(guān)(P ＜ 0.05)，與Tr極顯著正相關(guān) (P ＜ 0.01)，與 Ci極顯著負相關(guān) (P ＜ 0.01)；株高、葉寬與葉綠素含量、Pn、Tr極顯著(P ＜ 0.01)或顯著 (P ＜ 0.05)正相關(guān)，與 Ci極顯著負相關(guān) (P ＜ 0.01)；葉長、CP與葉綠素含量極顯著(P ＜ 0.01)或顯著(P ＜0.05)正相關(guān)，與 Ci極顯著 (P ＜ 0.01)或顯著 (P ＜ 0.05)負相關(guān)；EE與與Ci極顯著負相關(guān)(P ＜ 0.01)，與Pn、Tr、葉綠素含量極顯著正相關(guān)(P ＜ 0.01)；Ash、ADF、NDF與葉綠素含量極顯著(P ＜ 0.01)或顯著(P ＜ 0.05)負相關(guān)，與 Ci極顯著 (P ＜ 0.01)或顯著 (P ＜ 0.05)正相關(guān) (表 7)。

3 討論與結(jié)論

病毒是許多重要農(nóng)作物的病原，所造成的損失僅次于菌物病害[19]。苜?；ㄈ~病是一種苜蓿種植區(qū)普遍發(fā)生的病毒性病害，是限制苜蓿生產(chǎn)的重要生物因素之一。該病害的病原有10多種，癥狀略有不同，本研究中引起苜?；ㄈ~病的病原為苜?；ㄈ~病毒(AMV)，可侵染51科雙子葉植物，為苜蓿病毒病的主要病原，認識此類病害對牧草生長、生產(chǎn)和飼用價值具有重要的意義。

南志標(biāo)[20]研究證明，在田間隨機選取一定數(shù)量無病和染病程度不同的植株相比較的方法，是進行病害損失估計切實可行的方法之一。筆者連續(xù)3年對田間苜蓿不同茬次病害發(fā)生和苜蓿產(chǎn)量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，9月中下旬第3茬苜蓿的產(chǎn)量和花葉病害的發(fā)病率均約為全年4茬的平均值，可以反映花葉病給苜蓿當(dāng)年帶來的危害。因此，選取當(dāng)年9月中下旬第3茬初花期(收割前)苜蓿植株作為研究對象，對不同嚴(yán)重度花葉病害對其光合、生長、品質(zhì)的影響進行了詳細的分析。

苜蓿花葉病毒可引起植株矮化，葉或葉柄扭曲變形，葉片黃化斑駁皺縮，逐漸脫葉，嚴(yán)重時可引起植株死亡。葉片褪色及葉面積減少會直接影響葉綠素的含量及植株的光合同化，但目前國內(nèi)外還未見苜?；ㄈ~病對作物光合特性影響的相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿感染花葉病后，葉片的光合能力急劇下降(表1)。嚴(yán)重度1級及以上時，凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)胞間CO2濃度即與健株差異極顯著(P ＜ 0.01)。且隨著苜蓿花葉病害嚴(yán)重度而急劇下降，當(dāng)病害嚴(yán)重度為4級時，其Pn僅為健株的6.70%。同時葉綠素的含量也隨著花葉病的嚴(yán)重度增加而降低。與樊秦和李彥忠[21]、李揚等[22]、南志標(biāo)等[23]關(guān)于苜蓿莖點霉、假盤菌對苜蓿光合特性影響的結(jié)果一致。但寄主不同，病原菌對光合特性的影響也有差異。有文獻報道，病害侵染可提高作物的光合速率，如Chang等[24]發(fā)現(xiàn)小麥感染葉銹病后，光合速率升高，進而引起葉片中蔗糖積累增加，這是目前報道中的一個例外。

飼草的產(chǎn)量和營養(yǎng)價值是衡量其飼用價值高低的非常重要的指標(biāo)。粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)的含量是評價其營養(yǎng)價值的主要指標(biāo)[25]。苜?；ㄈ~病嚴(yán)重度1級及以上與健株生物量、EE差異極顯著(P ＜ 0.01)，ADF差異顯著(P ＜ 0.05)；嚴(yán)重度2級及以上與健株CP 差異極顯著 (P ＜ 0.01)，NDF 差異顯著 (P ＜ 0.05)，說明苜?；ㄈ~病嚴(yán)重影響了苜蓿的生長及營養(yǎng)價值。這一結(jié)果與苜蓿褐斑病對紫花苜蓿草品質(zhì)的影響以及銹病對3種豆科牧草的生長及營養(yǎng)成分的影響結(jié)果基本一致[20-21]。國內(nèi)外許多類似病害對飼草危害的研究中，雖探討的病原和寄主不同，但對生長及品質(zhì)的負面影響卻有著一致性[26]。根據(jù)本研究中生長、品質(zhì)與光合參數(shù)之間的相關(guān)性分析，本研究認為苜?；ㄈ~病侵染導(dǎo)致葉片黃化斑駁皺縮，葉綠素降解，影響植物的光合作用，進而影響苜蓿生長和品質(zhì)。