周娟娟，魏 巍，桑 旦，秦愛瓊，黃利春，汪麗軍

（1. 青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室 / 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院草業(yè)科學研究所，西藏 拉薩 850000；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)科爾沁右翼前旗農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 科爾沁 137713）

藏北地區(qū)位于青藏高原腹地，被稱為“世界屋脊的屋脊”，平均海拔4 500 m以上，氣候寒冷干旱，自然條件極為嚴酷[1]，卻肩負著國家生態(tài)安全屏障的使命，也承擔著西藏乃至全國畜牧業(yè)基地的重任。近年來，在藏北草原受生態(tài)保護和發(fā)展畜牧雙重壓力作用，草地生產(chǎn)力下降和草畜矛盾尖銳成為該區(qū)面臨的主要問題[2]。因此，開展栽培草地種植是保護生態(tài)、緩解高寒草地壓力、解決牲畜缺草問題的有效途徑。西藏自20世紀70年代開始引種工作，引進品種不下百余種，但在高寒特殊的氣候條件下，絕大多數(shù)品種不能安全越冬，很少能完成生育周期[3]。藏北地區(qū)越冬期低溫是多年生牧草生產(chǎn)面臨的瓶頸問題之一，篩選生態(tài)適應(yīng)能力強的鄉(xiāng)土草種成為解決上述問題的關(guān)鍵。早熟禾屬(Poa)植物資源豐富，全球有500余種，廣泛分布在涼冷濕潤區(qū)[4]，西藏記載有31種和1變種[5]，不同資源生長生境存在很大差異。因此，開展早熟禾屬資源開發(fā)利用對高寒區(qū)退化草地改良、緩解草畜壓力具有重要的實際意義。

許多研究表明，植物生理指標是評價抗逆性強弱的主要參數(shù)。張尚雄等[6]利用生理指標確定不同地區(qū)野生披堿草屬(Elymus)苗期抗寒性強弱，魏雙霞等[7]發(fā)現(xiàn)，與暖溫半干旱氣候區(qū)相比，種植在高寒區(qū)的紫花苜蓿(Medicago sativa)的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性等均有不同程度增加。呂優(yōu)偉等[8]發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下草地早熟禾(Poa pratensis)苗期可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、抗氧化酶活性與其耐寒能力正相關(guān)。那曲地區(qū)冬季漫長寒冷，低溫凍害時有發(fā)生，為馴化材料抗寒性研究提供了有利的環(huán)境條件。本研究以西藏本地不同海拔的早熟禾屬材料為研究對象，測定越冬前后其生理指標的變化規(guī)律，并計算各指標抗寒系數(shù)、隸屬函數(shù)值來綜合評價抗寒性強弱，以期為西藏高寒區(qū)多年生抗寒種質(zhì)資源的篩選提供方法，為早熟禾屬牧草的抗寒育種以及栽培草地建植提供技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗區(qū)位于那曲市那曲鎮(zhèn)的“藏北高寒草地生態(tài)科技園”內(nèi)，坐標 31°26' N，92°01' E，海拔 4 512 m。該區(qū)年平均氣溫為-2.2 ℃，極低溫低于-25 ℃，≥ 5 ℃ 年積溫為 940.6 ℃·d(1990-1999 年)[9]。年降水量為406.2 mm，年蒸發(fā)量為1 811.2 mm，年日照時數(shù)為2 789.9 h(1955-2011年)[10]。氣候干燥、多風。雨熱同季，降水主要集中在5-9月，無絕對無霜期，植物5月底返青，9月中旬枯黃，青草期100 d左右。研究區(qū)屬高原亞寒帶季風半濕潤氣候，土壤類型為高寒草原土，土壤有機質(zhì)缺乏，僅0.24%為礦質(zhì)土壤。土壤全氮、全磷和全鉀含量分別為2.37、0.68和3.91 g·kg-1，土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量分別為78.52、19.14和217.81 mg·kg-1，土壤pH 7.85。2016年入冬前(9月)至翌年返青期(5月)，月均氣溫與土壤溫度均在1月出現(xiàn)最低值，土壤0 - 10 cm土層溫度為-6.6 ℃，近地氣溫為-9.8 ℃(圖 1)。

1.2 供試材料

供試材料為藏北不同海拔采集的早熟禾屬野生種(表1)；對照(CK)是青海冷地早熟禾(栽培品種)，由青海畜牧獸醫(yī)科學院提供。

1.3 試驗設(shè)計

圖 1 2016年9月至2017年5月試驗區(qū)氣溫、土壤溫度變化Figure 1 Variation in air temperature and soil temperature in the test area from 2016 to 2017

試驗于2015年6月播種，播種時試驗小區(qū)施底肥，有機肥500 g·m-2，試驗小區(qū)采用隨機區(qū)組設(shè)計，小區(qū)面積3 m × 5 m = 15 m2，3次重復(fù)，人工開溝條播，播深3～5 cm，行距35 cm，播量1.5 g·m-2，小區(qū)之間起壟相隔，壟寬0.5 m。進行常規(guī)田間管理，播種第1年苗期進行人工拔除雜草。

1.4 測定項目和方法

1.4.1 越冬率

每個小區(qū)選擇1 m樣段分別于植物枯黃前(2016年8月31日)和翌年返青后(2017年6月2日)統(tǒng)計植株存活株數(shù)，計算越冬率(%)，越冬率 = (冬后返青苗數(shù)/入冬前植株數(shù)) × 100%。

1.4.2 生理指標

于入冬前(2016年9月10日)、最冷月(2017年1月15日)、返青期(2017年5月20日) 3個時期挖根采樣，室內(nèi)將根洗凈，取根頸下端5 cm根段放入-80 ℃ 冰箱保存，進行生理指標的測定，重復(fù)3次。

根系中的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化氫酶(CAT)活性分別采用蒽酮比色法、考馬斯亮藍染色法、TBA法、黃嘌呤氧化酶法和鉬酸銨比色法測定[11]。

1.5 分析方法

以文獻[12-13]分析方法為依據(jù)，通過4個材料越冬前后丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白和超氧化物歧化酶等指標的變化，進行抗寒性評價。計算各指標抗寒系數(shù)(cold-resistance coefficients，PI)、綜合抗寒系數(shù)(comprehensive cold resistance coefficient，RI)、隸屬函數(shù)值μ(x)，計算公式如下：

式中：Xs和Xc分別為越冬后和對照下各供試材料各指標的測定值，Xs為該指標在寒冷脅迫下的平均值，PIimin、PIimax為各性狀抗寒系數(shù)的最小值和最大值。

表 1 試驗材料采集地概況Table 1 Profile of seed collecting plots

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進行整理及圖表的繪制，利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件中Duncan檢驗對不同時期、不同材料間各項生理指標進行顯著性(0.05水平)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 早熟禾材料的越冬率

4個早熟禾材料越冬率均超過了80%，但不同材料之間越冬率存在明顯差異，由高到低依次為中亞早熟禾(P-1) ＞ 漸尖早熟禾(P-2) ＞ 冷地早熟禾(P-3) ＞ 青海冷地早熟禾(CK)，分別為88.50%、85.85%、84.54%和81.46%(圖2)。3個野生種的越冬率均顯著高于栽培品種 (P ＜ 0.05)。

圖 2 不同供試材料越冬狀況Figure 2 Wintering rate of four tested materials材料代號對應(yīng)的材料名稱如表1所列，下同。不同小寫字母表示不同材料間差異顯著(P ＜ 0.05)。The material codes are the same as those in Table 1. Difference lowercase letters indicate significant difference between different materials at the 0.05 level.

2.2 越冬期間根系生理指標變化

2.2.1 根系可溶性糖含量變化

圖 3 不同供試材料根系可溶性糖含量變化Figure 3 Change in soluble sugar content in roots of four tested materials柱狀圖上不同的小寫字母表示同一時期不同材料間的差異顯著性 (P ＜ 0. 05)。下同。Different lowercase letters on the bar chart indicate significance differences among different materials at the same time at the 0.05 level；similarly for the following figures.

CK、P-1、P-2和P-3可溶性糖含量變幅分別為30.53、22.85、12.28 和 13.04 mg·g-1(圖 3)。整個越冬期內(nèi)，CK、P-1可溶性糖含量隨時間推移逐漸上升，最大值出現(xiàn)在返青期(5月20日)；P-2和P-3可溶性糖呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，與氣溫變化相一致，最冷月可溶性糖含量高于入冬前與返青期。同一時期不同材料比較發(fā)現(xiàn)，入冬前4個材料根系可溶性糖含量存在顯著差異(P ＜ 0.05)，P-2含量最高；最冷月P-2和P-3的可溶性糖含量顯著高于CK和P-1 (P ＜ 0.05)，返青期P-2的含量顯著低于其他 3 個材料 (P ＜ 0.05)。

2.2.2 根系可溶性蛋白含量變化

整個越冬期內(nèi)，4個材料根系可溶性蛋白含量變化一致，均呈持續(xù)增加的變化趨勢，返青期與入冬前相比，CK、P-1、P-2和P-3根系可溶性蛋白含量分別提高了 0.73、0.84、0.96和 1.11 mg·g-1(圖4)。最冷月P-1、CK可溶性蛋白含量顯著低于P-2和P-3(P ＜ 0.05)；返青前P-1含量顯著低于P-3(P ＜ 0.05)。

圖 4 不同供試材料根系可溶性蛋白含量變化Figure 4 Change in SP content in the roots of four tested materials

2.2.3 根系丙二醛含量變化

整個越冬期內(nèi)，4種材料根系中丙二醛(MDA)的變化呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，與氣溫、表土溫度變化一致，均在最冷月達到最大值(圖5)。入冬前-最冷月MDA含量急劇增加，CK、P-1、P-2和P-3分別增加了21.16、13.62、15.40 和17.77 nmol·g-1；最冷月-返青期CK、P-1和P-2有小幅度降低，返青期MDA含量明顯高于入冬前。同一時期不同材料比較發(fā)現(xiàn)，入冬前不同材料MDA含量差異不明顯，最冷月和返青期，P-1的MDA含量最低。

圖 5 不同供試材料根系丙二醛含量變化Figure 5 Change in MDA content in the roots of the four tested materials

2.2.4 根系超氧化物歧化酶活性變化

圖 6 不同供試材料根系SOD活性變化Figure 6 Change in SOD activity in the roots of the four tested materials

整個越冬期內(nèi)，4種材料根系中超氧化物歧化酶(SOD)活性呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，CK和P-3從入冬前到返青期呈現(xiàn)升高的趨勢(圖6)；P-1和P-2呈現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，在最冷月活性最高，分別為822.68和868.21 U·g-1。入冬前-最冷月，P-1和P-2活性升高迅速，分別升高554.26和585.92 U·g-1。同一時期不同材料比較發(fā)現(xiàn)，4種材料根系超氧化物歧化酶活性有顯著差異(P ＜ 0.05)，在最冷月、返青期P-1、P-2活性均顯著高于CK和P-3 (P ＜ 0.05)。

2.2.5 根系過氧化氫酶活性變化

4種材料根系過氧化氫酶(CAT)活性隨越冬期間氣溫變化呈現(xiàn)不同的變化趨勢，入冬前-最冷月，隨氣溫降低，P-1、P-2材料CAT活性迅速升高，升高幅度分別為231.98和140.56 U·g-1(圖7)。最冷月-返青期，隨氣溫上升，P-1、P-2的CAT活性緩慢降低，降幅為49.14和39.18 U·g-1。而在整個越冬期內(nèi)，CK的CAT活性持續(xù)下降，降幅為23.86 U·g-1；P-3變化趨勢為持續(xù)升高，升高幅度為10.06 U·g-1。同一時期不同材料比較發(fā)現(xiàn)，在最冷月和返青期，4種材料根系過氧化氫酶活性差異顯著(P ＜ 0.05)，均以P-1材料的活性為最高。

圖 7 不同供試材料根系CAT活性變化Figure 7 Change in CAT activity in the roots of the four tested materials

2.3 供試早熟禾材料抗寒性評價

應(yīng)用單項指標進行抗寒性評定不能準確評價牧草抗寒等級。本研究以入冬前4種材料各性狀指標的測定值為對照值，計算單項指標的抗寒系數(shù)。通過綜合抗寒系數(shù)和隸屬函數(shù)法進行4種材料抗寒性等級評定。結(jié)果表明(表2)，綜合抗寒系數(shù)和隸屬函數(shù)法計算值，均表現(xiàn)出P-1的評價值為最大，值分別為2.164和為0.604，抗寒性最強。其次為P-2，值分別為2.114和0.501?？购栽u定較差的材料為青海冷地早熟禾(栽培品種)。

表 2 供試材料抗寒系數(shù)Table 2 Cold-resistance coefficients of tested materials

參照連續(xù)變數(shù)的次數(shù)分布統(tǒng)計方法[13]，將4種材料各性狀的抗寒系數(shù)以組距0.5分成7個組區(qū)間，制作成次數(shù)分布表(表3)。結(jié)果表明，在同一組區(qū)間各性狀的抗寒系數(shù)分布次數(shù)相差較大，在4種材料中，100%的可溶性蛋白含量的抗寒系數(shù)PI [1.0，1.5)，50%的SOD活性的抗寒系數(shù)PI ≥ 2.5，50%的丙二醛的抗寒系數(shù)PI ＜ 2.5，50%的可溶性糖含量的抗寒系數(shù)PI [1.0，1.5)。說明野生材料和其他栽培作物一樣，不同性狀對寒冷脅迫響應(yīng)的敏感程度不同，可溶性蛋白含量的反應(yīng)非常敏感，SOD活性、可溶性糖和丙二醛反應(yīng)較敏感。

3 討論與結(jié)論

3.1 滲透物調(diào)節(jié)物對抗寒性的影響

研究表明，可溶性糖是植物抗寒的一種保護物質(zhì)，也是植物安全越冬和翌年再生的物質(zhì)和能量來源，不同植物可溶性糖的含量不盡相同。當植物受到寒冷脅迫時，其含量的增加能夠提高細胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度，降低冰點，提高細胞的持水力，進而提高植物抗寒能力[14]。有研究表明，紫花苜蓿主根中可溶性糖在越冬前期隨越冬溫度下降明顯增加，在翌年返青含量又隨之降低[15]。低溫脅迫，早熟禾可溶性糖含量隨溫度下降呈現(xiàn)增加的趨勢[8]。本研究中，4個材料在入冬前(9月)至最冷月(1月)隨溫度降低，根系中可溶性糖含量呈現(xiàn)不同程度的增加，表明低溫脅迫過程，早熟禾根系通過增加可溶性糖積累，來降低植物保水能力，防止膜質(zhì)氧化，進而對根系起到保護作用。在最冷月至翌年返青期(5月)隨溫度回升，青海冷地早熟禾(栽培品種)和中亞早熟禾可溶性糖含量繼續(xù)升高。李軼冰等[16]在對美國引進的高山早熟禾和愛達荷冰草研究中也得出了相同的結(jié)論(即植物經(jīng)過冷凍處理后，在溫度回升的過程中植物可溶性糖含量是持續(xù)升高的)。而漸尖早熟禾和冷地早熟禾(野生種)有小幅度的下降，可能原因是此時供試材料已開始返青萌動，根系糖類物質(zhì)由保護物質(zhì)轉(zhuǎn)化為能量物質(zhì)，少量可溶性糖被消耗利用。

可溶性蛋白含量的變化與植物抗寒性的關(guān)系密切，植物受低溫脅迫時，通過增加蛋白來束縛更多的自由水，降低滲透勢，從而減少原生質(zhì)因結(jié)冰而傷害致死的機率[17]，提高植物抗寒性。南麗麗等[18]研究紫花苜蓿越冬期生理變化發(fā)現(xiàn)，根系中可溶性蛋白含量隨氣溫的降低而增加，隨翌年氣溫的回升又呈現(xiàn)小幅度降低。也有研究顯示，可溶性蛋白與溫度無相關(guān)性[19]。本研究，入冬前至返青期可溶性蛋白含量持續(xù)增加。這種相悖的研究結(jié)果可能與不同材料返青恢復(fù)時間有關(guān)，關(guān)于返青多長時間后才能消除寒冷對可溶性蛋白積累的滯后效應(yīng)還需進一步研究。

表 3 供試材料各性狀指標的抗寒系數(shù)在不同區(qū)間的分布Table 3 Different distribution of cold-resistance coefficients of tested varieties

3.2 丙二醛和抗氧化酶對抗寒性的影響

低溫脅迫能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生氧自由基，高濃度的氧自由基會迫害植物細胞膜質(zhì)，造成細胞死亡[20]，SOD和CAT作為抗氧化酶防御系統(tǒng)的主要酶系，可降解細胞內(nèi)有害自由基[21]，對增強植物抗寒性有重要作用。本研究中，入冬前至最冷月，隨氣溫降低，中亞早熟禾和漸尖早熟禾根系中SOD和CAT活性迅速升高，表明該時間段酶活性較高可有效清除細胞內(nèi)自由基，膜質(zhì)的抗氧化作用較強。最冷月至返青期酶活性降低較為緩慢，說明此階段該區(qū)空氣溫度、土壤溫度仍然處于較低水平，SOD和CAT還能夠?qū)υ缡旌谈涤泻芎玫谋Ｗo作用。反觀野生冷地早熟禾和青海冷地早熟禾，在寒冷脅迫下，SOD和CAT活性提升較為緩慢，抗寒能力相對較弱。

丙二醛是植物遭受低溫脅迫氧自由基積累造成細胞膜質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物。其量的大小直接關(guān)系到細胞膜被毒害程度。因此，也被作為衡量植物抗寒性的重要參數(shù)[22-23]。本研究中，4個材料根系丙二醛含量水平偏低，表明它們對寒冷環(huán)境都有較好的適應(yīng)性。隨越冬期間溫度的降低丙二醛含量總體呈上升的趨勢，說明植物在寒冷脅迫下，不同材料細胞膜質(zhì)過氧化有一定程度增加。中亞早熟禾和漸尖早熟禾升高幅度較慢，最冷月至返青期含量逐漸趨于緩和，表明這兩種早熟禾在寒冷環(huán)境下膜質(zhì)過氧化程度較低，具有較強的清除氧自由基的能力，Bonnecarrere等[24]在水稻(Oryza sativa)的研究中也有相同結(jié)果。

3.3 早熟禾抗寒評價

植物越冬期抗寒能力是其生理生化特性綜合作用的結(jié)果，利用單一的指標很難判定植物對寒冷的適應(yīng)能力。Fuzzy數(shù)學隸屬函數(shù)法被廣泛運用在紫花苜蓿[18]和禾本科牧草[16]越冬及混播草地建植[25]的抗寒性評判中，并得到了較為滿意結(jié)果。本研究利用隸屬函數(shù)法和綜合抗寒系數(shù)對早熟禾植物根系中可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶5項指標進行綜合分析，隸屬函數(shù)值和綜合抗寒系數(shù)均表現(xiàn)出相同的指示結(jié)果，抗寒性順序為中亞早熟禾 ＞ 漸尖早熟禾 ＞ 冷地早熟禾(野生種) ＞ 青海冷地早熟禾(栽培種)。

4 結(jié)論

藏北高寒區(qū)常年低溫，不同野生早熟禾的抗寒性不同。越冬期參試早熟禾材料根系的SOD活性和CAT活性均隨氣溫下降而升高，進入最冷月開始下降；而可溶性蛋白含量隨氣溫下降而上升，翌年返青后繼續(xù)隨氣溫升高持續(xù)升高。采用綜合抗寒系數(shù)、隸屬函數(shù)對4個供試早熟禾的生理指標進行綜合分析，抗寒性強弱依次為中亞早熟禾、漸尖早熟禾、冷地早熟禾和青海冷地早熟禾，與越冬率的表現(xiàn)一致。