俞發(fā)榮，李建軍，連秀珍，李登樓，謝明仁

(甘肅省證據(jù)科學技術研究與應用重點實驗室(甘肅政法大學)，蘭州 730070)

統(tǒng)計結果表明，精神依賴物海洛因濫用是目前濫用最嚴重,危害最大的毒品之一[1]。近年來，在精神依賴物海洛因濫用的人群中,女性濫用人數(shù)明顯上升[2],其中育齡婦女約占1/5～1/3。動物實驗結果表明：精神依賴物海洛因在引起母體損傷[3]的同時，可迅速通過胎盤屏障和胚胎血-腦脊液屏障，對胎兒產生毒性作用[4]。孕婦吸毒1 h后，在胎兒體內測出有海洛因代謝產物嗎啡存在。海洛因可直接作用于胚胎發(fā)育的各個時期，導致胚胎組織器官發(fā)育不全或畸形[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，海洛因成癮大鼠中腦腹側被蓋區(qū)(VAT)Bax基因表達水平明顯升高[6]。劉學紅等[7]應用免疫組織化學法研究發(fā)現(xiàn)，在人胚胎舌上皮組織細胞中均有Bax蛋白陽性表達，說明Bax基因參與調控人胚胎組織細胞的分化發(fā)育。Bax基因屬于Bcl-2基因家族，Bax基因表達不僅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且具有促進細胞凋亡的功能。若Bax基因表達異常,將導致胚胎組組織器官發(fā)育畸形[8]。本文在前期研究的基礎上,以Wistar大鼠為實驗對象，建立海洛因孕鼠模型，在大鼠胚胎發(fā)育期給予不同劑量的海洛因，觀察海洛因對胚胎發(fā)育及腦組織中Bax表達的影響，為研究精神依賴物海洛因的遺傳毒性機制積累參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠90只(雌60只，雄30只)，體重200～210 g，來源于甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心【SCXK(甘)2015-0001】。實驗在甘肅政法大學SPF級動物實驗室進行【SYXK(甘)2015-0006】。實驗按3R原則給予實驗動物人文關懷。倫理委員會審批號：GZF-2019-002。

1.1.2 試劑與儀器

海洛因，含量86.8%，蘭州市公安局提供；Bax ELISA kit，上海將來實業(yè)股份有限公司提供；酶標儀， Thermo MK3公司提供。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠分組、給藥

全部大鼠在SPF級實驗室IVC飼育盒飼養(yǎng)7 d，雌:雄按2∶1合籠飼養(yǎng)。合籠第2天用光學顯微鏡觀察陰道拭子涂片，有精子者視為交配“受孕”。將“孕鼠”隨機分為：①對照組，10只孕鼠，肌肉注射生理鹽水2 mL/(kg·bw)；②海洛因組高劑量組，肌肉注射海洛因64 mg/(kg·bw)；③海洛因中劑量組，肌肉注射海洛因32 mg/(kg·bw)；④海洛因低劑量組，肌肉注射海洛因16 mg/(kg·bw)，每組10只孕鼠。各組均從受孕第7天開始給藥，連續(xù)給藥9 d。

1.2.2 胚胎子鼠發(fā)育觀察

受孕第20天，乙醚麻醉孕鼠，無痛解剖開腹部，全切取子宮檢查吸收胎、死胎及活胎數(shù)，并對胎鼠進行體表形態(tài)檢查。

1.2.3 胚胎子鼠腦組織Bax水平檢測

剝取各組胚胎子鼠大腦額葉皮質和小腦皮層，各稱取500 mg，用勻漿研磨器研磨，離心機2000 r/min,離心15 min，取上清，用ELISA法檢測Bax水平。

1.2.4 標準曲線和標準曲線的直線回歸方程制作

以Bax標準品濃度為橫坐標，吸光度(OD)為縱坐標做標準曲線和標準曲線的直線回歸方程。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 海洛因對大鼠胚胎發(fā)育的影響

受孕第20天，解剖開腹部，全切取子宮檢查胚胎數(shù)、死胎及活胎數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)，海洛因高、中、低劑量組活胚胎總數(shù)比對照組減少了48.48%、37.12%和27.27%。(表1)

活體檢查看出，海洛因低劑量組胚胎枕骨發(fā)育不全，胚胎出現(xiàn)腦膨出畸形；海洛因中劑量組胚胎枕骨、頂骨發(fā)育不全，胚胎腦膨出明顯；海洛因高劑量組胚胎枕骨、頂骨、顳骨發(fā)育不全，胚胎腦膨出更為明顯，部分胚胎出現(xiàn)四肢及指骨發(fā)育不全。(圖1)

表1 海洛因對大鼠胚胎發(fā)育的影響Table 1 Effect of heroin on the embryonic development of rats

注A：對照組胚胎。B：海洛因低劑量組胚胎：枕骨發(fā)育不全，胚胎出現(xiàn)腦膨出畸形。C：海洛因中劑量組胚胎：枕骨、頂骨發(fā)育不全，胚胎腦膨出明顯。D：海洛因高劑量組胚胎：枕骨、頂骨、顳骨發(fā)育不全，胚胎腦膨出更為明顯。圖1 海洛因對大鼠胚胎發(fā)育的影響Note. A, Embryos in the control group. B, Occipital bone hypoplasia, embryonic encephalocele deformity in the low dose heroin group. C, Embryos in the medium-dose heroin group: occipital and parietal bone hypoplasia, obvious embryonic encephalocele. D, Embryos in the high-dose heroin group: occipital, parietal and temporal bone hypoplasia, and more obvious embryonal encephalocele.Figure 1 Effect of heroin on embryonic development of the rats

2.2 海洛因對胚胎子鼠大腦額葉皮層Bax表達水平的影響

以Bax標準液濃度為橫坐標，吸光度(OD)為縱坐標做標準曲線和標準曲線的直線回歸方程。(圖2)

將胚胎子鼠大腦額葉皮層OD代入直線回歸方程，海洛因低、中、高劑量組胚胎子鼠大腦額葉皮層中Bax水平比對照組增加了11.41%、47.06%和83.74%(P< 0.05,P< 0.01)。(圖3)

圖2 Bax標準曲線和標準曲線的直線回歸方程Figure 2 Bax standard curve and linear regression equation of the standard curve

2.3 海洛因對胚胎子鼠小腦組織Bax表達水平的影響

將小腦組織OD代入上述Bax直線回歸方程，海洛因低、中、高劑量組胚胎小腦組織中Bax表達水平比對照組增加了17.16%、52.96%和90.01%(P< 0.05,P< 0.01)。(圖4)

注：與對照組比,*P<0.05，**P<0.01。下圖同。圖3 海洛因對胚胎子鼠大腦額葉皮層Bax表達水平的影響Note.*P< 0.05，**P< 0.01 vs. the control group.(The same in the following figures)Figure 3 Effect of heroin on Bax expression level in the rat embryonic brain tissue

圖4 海洛因對胚胎子鼠小腦組織Bax表達水平的影響Figure 4 Effects of heroin on Bax expression level in the rat embryonic cerebellar tissue

3 討論

近年研究表明，精神依賴物海洛因濫用嚴重影響母體健康[9]，直接損害腦組織神經元[10]、星形膠質細胞[11]、顆粒細胞[12]和免疫系統(tǒng)[13]，使血-腦脊液屏障的通透性發(fā)生改變，從而誘導大腦損傷和腦功能異常[14]，引起周圍神經損傷[15]，導致神經發(fā)生退行性病變[16]。王園園等[17]報道，孕婦濫用海洛因將影響胚胎大腦正常發(fā)育,影響子代的學習記憶能力[18]。李重陽等[19]給小鼠仔鼠注射海洛因20 d, 仔鼠下丘腦和海馬凋亡細胞及Bax蛋白陽性表達細胞的數(shù)明顯高于對照組，并隨著海洛因劑量的遞增陽性表達細胞的數(shù)量呈增多趨勢。許梓楓等[20]報道，海洛因濫用不僅影響胚胎正常發(fā)育，出現(xiàn)宮內死胎、流產、早產，增加新生兒及嬰兒死亡的概率，還使子代表觀遺傳性發(fā)生改變[21]。胚胎解剖發(fā)現(xiàn)，給予孕鼠海洛因后，活胚胎率明顯降低，胚胎表型發(fā)育受到干擾。由于胚胎顱骨發(fā)育受到干擾，腦膨出畸形胚胎數(shù)顯著增加，實驗結果與許梓楓等報道結果相一致。ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，胚胎大腦組織細胞Bax表達水平隨給予海洛因劑量的增加而升高。結果提示，Bax基因是促進細胞凋亡的主要基因，Bax基因表達的蛋白可能抑制胚胎發(fā)育和組織器官的形成，或破壞胚胎新形成組織器官，出現(xiàn)畸形胚胎或死胎。海洛因通過母體干擾胚胎表型和組織器官的發(fā)育，誘導胚胎組織細胞Bax基因表達的分子生物學機制有待進一步實驗研究。